RECOMBINANT PICP PROTEIN, AND METHOD FOR PREPARING ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING THERETO

【명세세

【발명의 명칭】

재조합 PICP 단백질 및 이에 특이적으로 결합하는 항체의 제조방법

【기술분야】

. 본 발명은 재조합 PICP 단백질 및 이에 특이적으로 결합하는 항체의 제조방 법에 관한 것으로， 보다 상세하게는 PICP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단 편, 이를 포함하는 효소면역분석 (ELISA) 키트와 대사성 골진환 진단용 조성물， 이를. 이용한 PICP의 검출 방법, 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 와 이를 포함하는 재조합 발현 백터， 상기 재조합 발현 백터로 형질전환된 세포， 그 리고 상기 재조합 발현 백터를 이용하여 PICP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법과 재조합 PICP 단백질의 제조방법에 대한 것이다ᅳ

【배경기술】

본 출원은 2015년 12월 30일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0189684호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌^ΰ1다. ' 콜라겐 (collagen)은 동물의 결합 조직의 세포 외 기질의 주요 구성 단백질이 다. 포유류에서는 가장 많이 발현되는 단백질 증 하나로， 총 발현 단백질의 약- 25-35%를 차지하는 것으로 추정된다. 콜라겐은 섬유의 형태를 갖는 단백질로， 인대， 힘줄， 피부 둥의 섬유조직에서 주로 발견된다.

그 증 제 1형 콜라겐 (collagen type I)은 인체에서 가장 많이 발현되는 콜라겐 으로 콜라겐 섬유 (fiber)를 구성하며， 힘즐， 인대, 근육 섬유， 뼈, 진피층， 치아의 덴틴 등에서 발현되며， 상처 재생 과정에서 남는 흉터 조직 (scar tissue)에서도 많이 발견 된다. 제 1형 콜라겐은 콜라겐 il 사슬 (collagen alpha 1 chain 또는 alpha-1 type collagen), 그리고 제 1형 콜라겐 α2사슬 (collagen alpha 2 chain)의 폴리펩티드가 2:1 의 비율로 서로 감긴 이종삼량체의 삼증 나선 (helix) 구조로 되어 있으며 .약 285kDa 의 분자량을 갖는다. 제 1형 콜라겐은 다른 콜라겐과 마찬가지로 프로콜라겐이라고 불리는 전구체로부터 생성되는데， 프로콜라겐은 삼중 나선 구조를 갖는 콜라겐 외에 N-말단과 C-말단에 특정 프로테아제에 의해 잘려나가게 되는 프로펩티드 (pr^'opeptide)를 추가로 포함하고 있다. 세포 내에서 합성된 αΐ, α2 폴리펩티드는 소 포체에서 C—말단 프로펩티드 (C-terminal propeptide)로부터 삼중 나선의 섬유 구조 를 형성하기 시작하며， 삼증 나선 구조를 완성한 프로콜라겐은 세포 외부로 분비되 고， N-말단과 C-말단의 프로펩티드가 세포외 기질의 메탈로프로테나제 (metalloproteinase)에 의해 제거됨으로써 프로콜라겐이 콜라겐으로 성숙하게 된다. 성숙한 콜라겐은 서로 가교결합 (cross-linkage)하고 최종적으로 콜라겐 섬유를 형성 한다.

프로콜라겐이 콜라겐으로 성숙하는 과정에서， N-말단과 C-말단의 프로펩티 드가 정상적으로 절단되지 못하면 콜라겐의 삼증 나선 구조가 비정상적이 되어 콜 라겐 기능에 결함올 가져온다. 또한 제 1형 콜라겐 섬유들은 특히 뼈를 구성하고 지 지하는 증요한 역할을 하기 때문에 αΐ 또는 α2 사슬에 돌연변이가 생기면 취약성 골절 (brittle bone diseases) 등 골형성부전 (osteogenesis imperfecta)을 일으키게 된 다. 제 1형 프로콜라겐 C—말단 프로펩티드 (procollagen type 1， C— terminal propeptide, PICP)는 제 1형 프로콜라겐이 삼증 나선 구조를 형성하는데 필수적이고， 콜라겐 성숙 과정에서 분리되어 나오기 때문에 콜라겐 대사를 측정하는 증요한 지 표가 된다. 제 1형 프로콜라겐은 골아세포 (osteoblast), 조연골아세포 (chondroblast) 등 에서 생성되어 분비되고， 뼈와 관절의 형성과 기능에 증요하기 때문에 PICP는 뼈의 성장， 골다공증， 관절염과 같은 뼈와 관절의 질환의 마커로 이용될 수 있다.

따라서 PICP를 높은 민감도로 검출할 수 있는 기술 개발이 필요하다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

이에 본 발명자들은 단백질 복합체인 PICP의 재조합 단백질을 처음으로 제 작하고， scFv phage library와 yeast Fab library를 스크리닝하여 재조합 PICP 단백 질에 특이적인 항체의 단편을 선별하고， 통상적으로 사용되는 IgG 형태로 전환한 신 규한 항체를 개발하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은

서열번호 1， 서열번호 13， 서열번호 25 및 서열번호 37로 이루어진 군에서 선 택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 3, 서열번 호 15， 서열번호 27 및 서열번호 39로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포 함하는 증쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 5， 서열번호 17， 서열번호 29 및 서열번호 41로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 상보성 결 정부위 3(CDR3)를 포함하는 증쇄가변영역 (VH) 및 서열번호 7， 서열번호 19， 서열번 호 31 및 서열번호 43으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열올 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 l(CDRl); 서열번호 9， 서열번호 21， 서열번호 33 및 서열번호 45로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 11， 서열번호 23， 서열번호 35 및 서열번호 47로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역 (VL)을 포함하는 PICP(procollagen type I C— terminal propeptide)에 특이적으로 결 합하는 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 효소면역분석 (ELISA) 키트를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 대사성 골질환 진단용 조성물 올 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 구성되는 대사성 골질환 진단용 조성 물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 대사성 골질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은

대사성 골질환 진단용 제제를 제조하기 위한， 본 발명의 항체 또는 그 단편 의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은

하기의 단계를 포함하는， 개체의 대사성 골질환 진단 방법을 제공하는 것이다:

(a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;

(b) 본 발명의 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 PICP 단백질 수준을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 PICP 단백질 수준을 정상개체의 PICP 단백질 수준과 비교하는 단계. 본 발명의 또 다론 목적은

(1) 시료를 준비하는 단계;

(2) 본 명에 따른 항체 또는 그 단편을 상기 시료와 접촉시키는 단계; 및

(3) 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 PICP 특이적인 검 출 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하 는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은

상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은

상기 재조합 발현 백터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은

(a) 상기 재조합 발현 백터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;

(b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하는 단계;

(c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함하는 PICP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법을 제공하는 것이 다. 본 발명의 또 다른목적은

(i) 세포 외 분비를 촉진하는 시그널 펩티드와 표지 단백질이 접합된 PICP α 1 사슬과 PICP α2사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백 터를 제조하는 단계;

(ii) 상기 PICP αΐ 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터와 PICP Q2 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 혼합하여 세포를 공동형질전환 (co-transfection)하는 단계;

(iii) 상기 공동형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및

(iv) 상기 세포에서 생성된 PICP 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 재조합 PICP 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

서열번호 1， 서열번호 13， 서열번호 25 및 서열번호 37로 이루어진 군에서 선 택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 l(CDRl); 서열번호 3， 서열번 호 15， 서열번호 27 및 서열번호 39로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포 함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 5, 서열번호 17， 서열번호 29 및 서열번호 41로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 상보성 결 장부위—3(G3DR3)를 포함하는 중쇄가변영역 (VH) 및 서열번호 7， 서열번호 19， 서열번 호 31 및 서열번호 43으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 l(CDRl); 서열번호 9, 서열번호 21， 서열번호 33 및 서열번호 45로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 11， 서열번호 23， 서열번호 35 및 서열번호 47로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역 (VL)을 포함하는 PICP(procollagen type I C-terminal propeptide)에 특이적으로 결 함하는 항체 또는 그 단편을 제공한다. - . 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 효소면역분석 (ELISA) 키트를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

- 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 대사성 골질환 진단용 조성물 을 제공한다.

또한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 구성되는 대사성 골질환 진단용 조성 물을 제공한다..

또한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 대사성 골질환 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

대사성 골질환 진단용 제제를 제조하기 위한, 본 발명의 항체 또는 그 단편 의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

하기의 단계를 포함하는， 개체의 대사성 골질환 진단 방법을 제공한다:

(a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;

(b) 본 발명의 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 PICP 단백질 수준을 측정하는 단계; 및

：. (c) 상기 PICP 단백질 수준을정상개체의 PICP 단백질 수준과 비교하는 단계. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

(1) 시료를 준비하는 단계;

(2) 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 상기 시료와 접촉시키는 단계; 및

(3) 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 PICP 특이적인 검 출 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한 다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적올 달성하기 위하여， 본 발명은

상기 재조합 발현 백터로 형질전환된 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

(a) 상기 재조합 발현 백터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;

(b) 형¾전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하는 단계;

(C) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함하는

PICP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

(i) 세포 외 분비를 촉진하는 시그널 펩티드와 표지 단백질이 접합된 PICP α 1 사슬과 PICP α2사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백 터를 제조하는 단계; ᅳ

(ii) PICP αΐ 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터와 PICP α2 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터 를 혼합하여 세포를 공동형질전환 (co-transfection)하는 단계;

(iii) 상기 공동형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및

(iv) 상기 세포에서 생성된 PICP 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 재조합 PICP 단백질의 제조방법을 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명자들은 단백질 삼중복합체인 재조합 PICP 단백질을 성공적으로 제조 하고， 인간 유래 scFv phage library와 yeast Fab library를 스크리닝하여 재조합 PICP에 특이적으로 결합하는 항체의 단편을 선별하였다. 선별된 항체의 단편은 IgG 형태의 항체로 전환된 후에도 piCP에 대한 결합친화력 (affinity)과 결합특이성 (specificity)을 유지하며， 유사 항원에 대한 교차반웅성도 거의 없음을 확인하였다. 이에 따라 본 명세서에서는 PICP에 특이적이고 교차반웅성이 낮은 것으로^'확인된 중쇄와 경쇄의 상보성 결정부위 (CDR) 그리고 이들을 포함하는 중쇄가변영역 (VH)과 경쇄가변영역 (VL)의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 항체의 제조방법， 항체를 이 용한 검출 방법을 제공한다. 본 발명에서 'PICP(procollagen type I C—terminal propeptide) '는 특이적 엔 도펩티다제인 BMP bone morphogenic protein 1)에 의해 절단되어 생성되는 제 1형 프로콜라겐 (procollagen type 1)의 C—말단 부위 단편을 의미한다. PICP는 2개의 제 1 형 프로콜라겐 αΐ 사슬 (chain)과 1개의 α2 사슬 폴리펩티드로 구성된 삼량체의 구형 단백질이다 프로콜라겐 αΐ 사슬은 인간에서 COL1A1 유전자에 암호화되어 있는 1464개의 아미노산으로 구성된 단백질이다. 프로콜라겐 α2 사슬은 COL1A2 유전자 에 암호화되어 있는 1366개의 아미노산으로 구성된 단백질이다. 본 발명에서 '항체 (antibody)'는 면역 글로불린 (immunoglobulin, Ig)이라고도 불리며， 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 자 연에서 발견되는 전체 항체 (whole antibody)는 일반적으로 여러 도메인으로 이루어 진 폴리펩티드인 경쇄 (light chain, LC) 및 중쇄 (heavy chain, HC)의 2개 쌍으로 이 루어지거나， 이들 HC/LC의 2개의 쌍으로 된 구조를 기본 단위로 한다. 포유류의 항 체를 구성하는 중쇄의 종류는 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 유형이 있으며， 중쇄의 종류에 따라 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 둥 다른 종류의 항체 를 구성하게 된다. 포유류의 항체를 구성하는 경쇄의 종류는 λ 및 κ로 표시되는 2가 지 종류가 존재한다.

항체의 증쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역 과 불변영역으로 구분된다. 증쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CHI, CH2 및 CH3(IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄불변 영역으로 구성되어 있으며， 경쇄는 1개의 불변영역인 CL으로 구성되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역 (VH) 또는 경쇄가변영역 (VL)의 하나의 도메 인으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되 어 1개의 공유 이황결합 (disulfide bond)에 의해 연결되고， 경쇄와 결합한 두 분자의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며， 전체 항체는 2개의 증쇄 및 경쇄의 쌍 (HC LC)으로 구성되어 있으므로， 한 분자의 전체 항체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일특이성을 갖 게 된다. 항체가 항원에 결합하는 부위를 포함하는 가변영역은 서열 가변성이 적은 골 격 부위 (framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위 (hypervariable region)인 상보성 결정부위 (complementary determining region, CDR)로 세분된다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 N—말단부터 C—말단의 방향으로 FR1一 CDR1-FR2— CDR2-FR3-CDR3— FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영역 안에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로， 항체의 항 원 특이성에 가장 증요하다. 본 발명에 따른 PICP에 특이적으로 결합하는 항체는

서열번호 1， 서열번호 13， 서열번호 25 및 서열번호 37로 이루어진 군에 서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 l(CDRl); 서열번호 3， 서열번호 15, 서열번호 27 및 서열번호 39로 이루어진 군쎄서 선택된 아미노 산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 5， 서열번호 17， 서열번호 29 및 서열반호 41로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하 는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 중쇄가변영역 (VH) 및 서열번호 7， 서열번호 19， 서열번호 31 및 서열번호 43으로 이루어진 군에서 선택된 아미 노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 l(CDRl); 서열번호 9， 서열번호 21, 서열번호 33 및 서열번호 45로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포 함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 11， 서열번호 23， 서열번호 35 및 사열번호 47로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보 성 결정부위 3(CDR3)를 포함하는 경쇄가변영역 (VL)을 포함한다. 본 발명에 따른 PICP에 특이적으로 결합하는 항체는 바람직하게는 아래와 같은 중쇄와 경쇄의 가변영역의 CDR의 구성을 갖는 항체이다:

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1， 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서 열¾호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하 는 중쇄가변영역 (VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상 보성 결정부위 1， 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결 정부위 2 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열올 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 3을 포함하는 경쇄가변영역 (VL)을 포함하는 항체; 또는

서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 상보성 결정부위 3을 포함 하는 중쇄가변영역 (VH) 및 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1， 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역 (VL)을 포함하는 항체; 또는

서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1， 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서 열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하 는 중쇄가변영역 (VH) 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1， 서열번호 33으로 표시되는 아마노산 서열을 포함하는 경쇄 상보 성 결정 -부위 2 및 -서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성^' 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역 (VL)을 포함하는 항체; 또는

서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1， 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 상보성 결정부위 2 및 서 열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 상보성 결정부위 3을 포함하 는 중쇄가변영역 (VH) 및 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1， 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열올 포함하는 경쇄 상보성 결 —정:부위 3을포함하는 경쇄가변영역 (VL)을 포함하는-항체. 또한 상기 PICP에 특이적으로 결합하는 CDR의 구성을 갖는 항체는 서열번 호 49， 서열번호 53， 서열번호 57 및 서열번호 61로 이루어진 군에서 선택된 아미노 산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 (VH)과 서열번호 51， 서열번호 55， 서열번호 59 및 서열번호 63으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 (VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체일 수 있다. 상기 중쇄가변영역 (VH)과 경쇄가변영역 (VL)을 포함하는 항체는 구체적으로 는 서열번호 69， 서열번호 73， 서열번호 77 및 서열번호 81로 이루어진 군에서 선택 된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 71, 서열번호 75, 서열번호 79 및 서열번호 83로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄로 이루어진 것을 특징으로 하는 항체일 수 있다.

가장 바람직하게는 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 및 서열번호 기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 73로 표시되 는 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 및 서열번호 75로 표시되는 아미노산 서열을 포 함하는 경쇄; 서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 및 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 i함하는 경쇄; 서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 및 서열번호 83로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 를 포함하는 항체이다. 본 발명에 따른 PICP에 특이적으로 결합하는 항체는 상기한 CDR의 조합이 나^.， -VH와 VL 또는 경쇄와 중쇄의 구성을 갖는 것이라면 그 종류에 제한이 없다. 구 체적으로는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으 며， 특히 IgG 항체인 것이 바람직하다. 또한 1개의 B 세포에서 유래하는 단일클론 (monoclonal) 항체일 수도 있고， 복수의 B 세포에서 유래하는 다클론 (polyclonal) 항 체일 수도 있지만， 항체의 증쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체 의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소， 형광 물질， 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나， 이에 한정되 지는 않는다.

본 발명의 항체는 인간올 포함하는 포유동물， 조류 둥을 포함한 임의의 동물 ᅭ에서 유래한 것일 수 있으며， 바람직하게는 인간에서 유래한 것이거나， 인간에서 유 래한 항체의 부분과 다른 종의 동물에서 유래한 항체의 부분을 포함하는 키메릭 (chimeric) 항체일 수 있다. 또한 본 발명에서 항체의 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하 고 있는 항체의 단편을 의미하며， 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디 아바디 (diabody), scFv등의 형태일 수 있다.

Fab(fragment antigen—binding)는 항체의 항원 결합 단편으로， 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩 신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로， 두 개의 Fab가 중쇄 경첩 (hinge)에서 이 황결합 (disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 .단편의 이황 결합올 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩아부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역 (VH)과 경쇄가변영역 (VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디 (diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고， 동일한 형태 의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다. 본 발명의 목적상 항체의 단편은 PICP에 대한 결합특이성을 유지하고 있는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않지만， 바람직하게는 scFv일 수 있다. 즉， 본 발명에 따른 scFv는 상기한 PICP에 특이적인 CDR 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 것이며， 바람직하게는 서열번호 65 또는 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

또한 본 발명에 따른 항체의 단편은 Fab일 수도 있다. Fab는 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열 을 포함하는 VL올 포함하거나， 서열번호 61로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 63으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 효소면역 -분^ (ELISA) 키트를제공한다. 본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 재조합 PICP를 이용하여 선별된 항체와 단편을 이용하여 ELISA 반웅을 실시하였다. 특히 scFv 클론 2D의 가변영역 을 포함하는 IgG를 이용한 샌드위치 엘라이자 (sandwich ELISA) 반웅에서는 검출한 계는 lng/ml으로 PICP를 민감하게 감지할 수 있고， 유사 단백질인 PIIICP에는 전혀 교차반웅성이 없어 ELISA 키트로 효용성이 높음을 확인하였다. 이에 본 발명에 따 른 PICP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 이용하여 PICP를 정량적으로 감지할 수 있는 효소면역분석 (ELISA) 키트를 제공한다.

ELISA 키트는 효소 (enzyme)와 결합된 항체를 이용하여 표적 물질을 검출하 거나 정량적으로 분석하기 위하여 사용되는데， 비특이적 반응은 즐이고， 항원 민감성 과 결합특이성을 높이기 위하여 통상적으로 sandwich ELISA의 형태로 제작된다. Sandwich ELISA는 표적 물질을 검출하기 위하여 표적 물질에 특이적으로 결합하 는 두 종류의 항체를 이용하는 방법으로， 첫 번째 항체 (capture antibody)는 반웅용 기 표면에 부착되어 있고, 발색 반웅을 위한 효소와 결합되어 있는 두 번째 항체 (detection antibody)는 반응 용액에 포함되어 있다. 먼저 첫 번째 항체가 고정되어 있는 반웅용기에 시료 (또는 샘플)를 첨가하여 표적 물질이 첫 번째 항체와 결합하도 록 반응시키고, 다시 두 번째 항체를 반웅시켜 최종적으로 항체 (capture)—표적 물질 -항체 (detection)의 샌드위치 형태의 복합체를 형성하게 된다. 마지막으로 두 번째 항체에 연결되어 있는 효소의 기질 (substrate)을 반웅용기에 첨가하여 효소의 발색 반웅을 진행하고, 발색 수준을 측정하여 시료 안에 포함되어 있는 표적 물질의 존재 유무와 농도 둥을 확인하게 된다. 시료 안에 표적 물질의 농도가 높을수록 반응용기 에 부착된 항체 (capture)-표적물질 -항체 (detection)의 복합체가 많이 형성되고， 발색 반웅을 할 수 있는 두 번째 항체가 반웅용기에 많이 존재하게 되므로, 발색 정도와 표작 물질의 농도는 양의 상관관계를 갖게 된다. 표적 물질의 농도를 확인하기 위하 여， 다양한 농도의 표준 물질로 ELISA 반웅을 수행하여 농도에 따른 발색 반웅의 표준 곡선을 작성하고， 시료의 ELISA 반웅에서 측정한 발색 반웅 수준을 표준 곡선 에 대웅하여 시료 안의 표준 물질의 농도를 도출하게 된다. 본 발명에 따른 ELISA 키트는 이와 같이 sandwich ELISA의 형태로 제조될 수 있으며， 본 발명에 따른 중쇄 및 경쇄가변영역을 포함하여 PICP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편이 표면에 고정되어 있는 반웅용기， 발색 반웅을 위한 효소가 연결된 항체， 발색 반웅을 위한 효소의 기질， 발색 반웅을 위한 반웅 용액 (또 는 버퍼)， 보조 인자 그리고 PICP의 표준 곡선을 작성하기 위한 표준 물질로서 특정 한 농도 시리즈의 PICP 단백질 등으로 구성될 수 있다. 특히 표준 물질로서 본 발 명의 방법에 따라 제조한 재조합 PICP 단백질을 사용할 수 있다. 발색 반웅을 위한 효소로는 당업계에서 ELISA 반웅을 위하여 통상적으로 이용되고， PICP와의 결합을 저해하지 않는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며， 예를 들어 HRPOiorse radish peroxidase) 효소와 이의 발색 기질로 tetramethylbenzimidine(TMB)를 사용할 수 있 다. TMB는 HRP의 촉매 작용에 의해 산화되어 청색으로 발색되며， 발색 수준은 605nm 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하게 된다. 한편 HRP 효소 반웅에 황산 ( SO₄)을 첨가하면 효소 작용이 중지되어 발색 반웅이 더 이상 진행하지 않고， 반 웅용액이 청색에서 황색으로 변화한다. 황산으로 안정화된 황색의 반웅 용액은 450nm 파장의 흡광도를 측정하여 확인하게 된다 본 발망은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 대사성 골 잘환 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 구성되는 대사성 골질환 진단용 조성 물을 제공한다.

또한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 대사성 골질환 잔단용 조성물을 제공한다. - 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 대사성 골질환 진단 용-제제를 제조하기 위한， 본 발명의 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다. 제 1형 콜라겐은 뼈를 구성하는 가장 중요한 유기물 성분이며， 제 1형 콜라겐 이 생성되는 과정에서 절단되어 혈액 둥 순환계로 방출되는 PICP는 뼈의 형성과 성 장과 밀접하게 관련된 콜라겐 합성의 정량적인 표지자로 이용될 수 있다. 체액 내

PICP의 수준은 특히 뼈의 전환 (turnover)이나 재생과 관련이 높은 골다공증， 갑상선 또는부갑상선 항진증으로 인한 골다공증, 골다공증의 전단계인 골감소증， 골성장장 애， 골암， 유방암， 폐암， 전립선암 둥의 전이로 인한 골전이암 둥의 질환 등에서 증가 되어 있는 것으로 보고된 바 있다. 따라서 본 발명에 따른 PICP에 특이적으로 결합 하는 항체 또는 그 단편을 포함하는 조성물은 뼈의 전환 또는 재생과 관련된 대사 성 골질환을 진단하는데 이용될 수 있다. 본 발명에서 대사성 골질환은 구체적으로 골다공증， 파제트병 (Paget's diseases), 골이영양증 (osteodystrophy), 골성장장애 (osteogenesis imperfecta), 골암， 골전이암 (metastatic bone disease), 골연화증 (osteomalacia), 골감소증 (osteopenia), 골위축 (bone atrophy), 섬유성골이형성증 (fibrous dysplasia), 고칼슘혈증 (hypercalcemia), 골용해 (osteolysis), 골관절염 (osteoarthritis), 치주질환 또는 류마티 스 관절염일 수 있으며， 바람직하게는 골다공증， 골감소증， 파제트병， 골이영양증， 골 성장장애， 골전이암일 수 있다. 본 발명의 용어 '~을 포함하는 (comprising)' 이란 '함유하는' 또는 '특징 으로 하는' 과 동일하게 사용되며， 조성물 또는 방법에 있어서， 언급되지 않은 추가 적인 성분 요소 또는 방법 단계 둥을 배제하지 않는다. 용어 ᅳ~로 구성되는 (consisting of)' 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소， 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 '필수적으로 구성되는 (essentially consisting of)' 이 란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서， 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 둥을 포함하 는 것을 의미한다. 또한 본 발명은

(1) 시료를 준비하는 단계;

(2) 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 상기 시료와 접촉시키는 단계;

(3) 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 PICP 특이적인 검출 방법올 제공한다. 상기 (1) 단계는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편올 이용하여 PICP 단백질 의一^ᅭ유무와 농도를 측정하기 위한 시료를 준비하는 단계이다. - 통상의 기술자는 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 공지의 방법올 적절하 게 선택하고， 선택된 방법에 적합하게 시료를 준비할 수 있다. 또한 시료는 대사성 골질환 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 생검 등으로 얻어진 세포나 조 직， 혈액， 전혈， 혈청， 혈장， 타액， 뇌척수액 둥일 수도 있다. 상기 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 방법이란 여기 제한되는 것은 아니나， 예를 들어 웨스턴 블랏， 면 역 블랏， 닷 블랏， 면역조직화학염색 (immunohistochemistry), 효소면역분석 (ELISA), 방사능면역검정법 (radioimmunoassay), 경쟁적 결합 분석， 면역침전 둥이 있다. 예를 들어 웨스턴 블랏을 실시하기 위하여서는 PICP를 포함하는 시료 또는 세포의 용해 물에 전기영동에 적합한 버퍼를 첨가하여 끓이는 둥의 방법으로 준비할 수 있으며， 면역조직화학염색을 위해서는 세포나 조직의 절편을 고정하고 블락킹 (blocking)하는 둥의 전처리를 할 수 있다.

^' 상기 (2) 단계는 (1) 단계에서ᅳ 준비된 시료에 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 접촉시키는 단계이다.

본 발명에 따른 항체는 앞서 서술한 CDR, VH와 VL 또는 중쇄와 경쇄의 구 성―을 갖는 PICP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편이다. 상기 항체는 바람 직하게는 G일 수 있으며， 항체와 단편은 scFv 또는 Fab일 수 있다. 상기 항체 또 는 단편의 종류와 범위에 대하여서는 앞서 서술한 바와 같다. 상기 (3) 단계는 (2) 단계에서 시료에 접촉한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 감지함으로써 시료 내 PICP 단백질의 존재 유무와 그 수준을 측정하는 단계 이다.

상기 (3) 단계를 수행하기 위한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 당업계 에 공지된 방법에 따라 형광， 방사성 동위원소， 효소 등으로 직접 표지되어 별도의 2 차 항체 없이도 감지할 수 있는 형태로 제조된 것일 수 있다. 방사능은, 예를 들어， 신틸레이션 계수 (scintillation counting)에 의해 측정될 수 있으며， 형광은 형광 현미 경을 이용하여 감지하고 정량할 수 있다. 또한 상기 효소는 예를 들어 루시퍼라제 (luciferase), 퍼옥시다제 (peroxidase), 갈락토시다제 (galactosidase) 등을 포함한다. 또 는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 형광， 방사능， 효소 등으로 표지된 2차 항체 를 이용하여 간접적으로 감지할 수 있다. 이외에도 본 발명에 따른 항체 또는 그 단 -편—은 -바이오틴 (biotin)에 접합된 형태로 제조되어， 적절히 표지된 스트랩토아비딘 (streptavidin)과 반웅시켜 감지할 수 있다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 하기의 단계를 포함 하는 개체의 대사성 골질환 진단 방법을 제공한다:

(a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; (b) 본 발명의 상기 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 PICP 단백질 수준을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 PICP 단백질 수준을 정상개체의 PICP 단백질 수준과 비교하는 단계. 본 명세서에서 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료 "는 혈액 및 생물학적 기 원의 기타 액상 시료， 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부 터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직， 추출물, 세포 용해물， 전혈， 혈장， 혈청， 침, 안구액, 뇌척수액， 땀， 뇨， 젖 , 복수 액， 활액, 복막액 둥일 수 있다. 상기 시료 는 동물， 바람직하게는 포유동물로부터 수득 될 수 있으며， 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득 될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과， 증류, 추출, 농축， 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 둥을 포함할 수 있다. 또한， 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다. 본 발명의 진단방법은， 정상개체의 생물학적 시료 내 PICP 단백질 수준을 대 사성 골질환 의심 개체의 생물학적 시료 내 단백질 수준과 비교함으로써 실제 질환 발병 여부를 진단할 수 있다. 즉， 대사성 골질환으로 추정되는 개체의 생물학적 사 료로부터 본 발명의 상기 항체 또는 그 단편을 이용해 PICP 단백질의 수준을 측정 하고， 정상개체의 생물학적 시료로부터 본 발명의 항체 또는 그 단편을 이용해

PICP 단백질 수준을 측정하여 양자를 비교한 후， 질환 의심 개체의 PICP 단백질 수 준이 정상개체의 것보다 더 높으면 이를 해당질환으로 진단할 수 있다. 따라서 상기 진단방법은 ' (d) 정상 개체의 PICP 단백질 수준보다 높은 경우 대사성 골질환이 발 병된 것으로 판정하는 단계.' 를 추가적으로 포함할 수 있다. 이는 전술한 바와 같 이 체액 내 PICP의 수준은 특히 뼈의 전환 (turnover)이나 재생과 관련이 높은 골다 -공증， 갑상선 또는 부갑상선 항진증으로 인한 골다공증， 골다공증의 전단계인 골감소 증， 골성장장애， 골암， 유방암， 폐암， 전립선암 둥의 전이로 인한 골전이암 둥의 질환 등에서 증가되어 있는 것으로 보고된 바 있는 것에 근거한다. 대사성 골질환에 대해 서는 전술한 바와 같다. 상기 진단 방법은 PICP 단백질과 본 발명의 항체 또는 그 단편들의 특이적 항원 -항체 반웅을 통하여 달성되는 것으로서, 상기 반웅에 의해 생성되는 항원 -항체 복합체의 생성량은 검출 라벨 (detect ion label)의 시그널의 크기를 통해 정량적으로 측정 가능하다. 본 발명에서 용어 '항원 -항체 복합체' 란 대사성 골질환의 마커인 PICP 단백질과 이에 특이적인 본원 발명의 항체 및 그 단편의 결합물을 의미한다. 상기 검출 라벨 (표지)은 효소， 형광물， 리간드， 발광물， 미소입자

(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며， 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제， β— D—글루코시다제， β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제， 글루코 즈 옥시다제， 핵소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스 포프럭토키나제， 포스포에놀피루베이트 카복실라제， 아스파르테이트 아미노트랜스페 라제， 포스페놀피루베이트 데카복실라제， β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않 는다. 형광물에는 플루오레신， 이소티오시아네이트， 로다민， 피코에리테린， 피코시아 닌， 알로피코시아닌， 0-프탈데히드， 플루오레스카민 둥이 있으며 이로 제한되지 않는 다. 리간드에는 바이오틴 유도체 둥이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아 —크리디늄 에스테르， 루시페린, 루시퍼라아제 둥이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미 소압자에는 콜로이드 금， 착색된 라텍스 둥이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센， 루테늄 착화합물， 바이올로젠， 퀴논， Ti 이온， Cs 이온， 디이미드， 1，4-벤조퀴논， 하이드로퀴논， K4 W(CN)₈ ， [Os(bpy)₃]²⁺ ， [RU(bpy)₃]²⁺, [MO(CN)₈]^4" 둥이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는³H,¹⁴C,³²P, ¾,³⁶C1, 5¹Cr,⁵⁷Co, ¾ο,⁵⁹Fe,⁹⁰Y,¹²⁵I,¹³¹I ,¹⁸⁶Re 둥이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏， ELISA, 방사선 면역분석， 방사 면역 확산법， 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동， 조직 ᅳ면—역—염색 (immunohistochemistry)， 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법， FACS, 단백 질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여， 정상 대조군에서의 항원 -항체 복합체의 형성량과 대사성 골질환 의심환자에서의 항원-항 체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고， PICP 생성량의 증가여부를 판단하여, 질병 의심 환자의 실제 대사성 골질환 발병 여부를 진단할 수 있다. 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오 티드를 제공한다. 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 PICP에 특이적 으로 결합하는 CDR의 구성 또는， VH와 VL, 또는 증쇄와 경쇄의 구성을 갖는 항체 를 암호화하는 염기서열을 말한다. 앞서 설명한 본 발명에 따른 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2(중쇄 CDR1), 서열번호 4(증쇄 CDR2), 서열번호 6 (중쇄 CDR3), 서열번호 8(경쇄 CDR1), 서열번호 10(경쇄 CDR2), 서열번호 12(경쇄

CDR3), 서열번호 14(증쇄 CDR1), 서열번호 16(중쇄 CDR2), 서열번호 18(중쇄

CDR3), 서열번호 20(경쇄 CDR1), 서열번호 22(경쇄 CDR2), 서열번호 24(경쇄

CDR3), 서열번호 26(중쇄 CDR1), 서열번호 28(중쇄 CDR2), 서열번호 30(증쇄

GDR3), 서열번호 32(경쇄 CDR1), 서열번호 34(경쇄 CDR2), 서열번호 36(경쇄

CDR3), 서열번호 38(중쇄 CDR1), 서열번호 40(중쇄 CDR2), 서열번호 42(중쇄

CDR3), 서열번호 44(경쇄 CDR1), 서열번호 46(경쇄 CDR2), 서열번호 48(경쇄

CDR3)에 기재되어 있다. 또한 본 발명에 따른 VH와 VL을 암호화하는 폴리뉴클레 오티드는 서열번호 50(VH), 서열번호 52(VL), 서열번호 54(VH), 서열번호 56(VL), 서열번호 58(VH), 서열번호 60(VL), 서열번호 62(VH), 서열번호 64(VL)에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 중쇄와 경쇄의 구성을 갖는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오 티드는 구체적으로는 서열번호 70， 서열번호 72， 서열번호 74， 서열번호 76， 서열번호 78, 서열번호 80， 서열번호 82 및 서열번호 84로 이루어진 군에서 선택된 염기서열일 수 있다. 항체의 증쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 70， 서열번호 74, 서열번호 78 및 서열번호 82로 이루어진 군에서 선택되며， 항체의 경쇄를 암호화하 는 폴리뉴클레오티드로서 서열번호 72， 서열번호 76， 서열번호 80 및 서열번호 84로 _의旱어진 -군에서 선택된다. 또한 상기 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 본 발명에 따른 scFv를 암호화하는 서열번호 66 또는 서열번호 68로 표시되는 염기서 열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 서열번호 58 및 서열번호 60으로 표시되는 염기 서열， 또는 서열번호 62 및 서열번호 64로 표시되는 염기서열을 포함하는， Fab를 암 호화하는 폴리뉴클레오티드일 수도 있다. 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편올 암호화하는 폴리뉴클레오 티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 제공한다. 본 발명에서 '재조합 (recombinant)'은 '유전자 조작 (genetic manipulation)'과 호환하여 사용될 수 있으며， 유전자에 변형올 가하고 자르고 연결하는 둥 분자적 클 로닝 (molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태 의 유전자를 제조하는 것을 의미한다. ᅳ 본 발명에서 '발현 (expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것 을의미한다. 본 발명에서 '재조합 발현 백터'란 적합한 숙주세포 (host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산 (RNA)을 발현할 수 있는 백터로서， 폴리뉴클레오티드 (유전자) 삽 입물아 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유 전자 작제물올 말한다. '작동가능하게 연결된 (operably linked)'이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열 이 기능적으로 연결 (functional linkage)되어 있는 것으로， 발현조절서열에 의해 유전 자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 '발현조절서열 (expression control sequence)'이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하 기 위한 프로모터， 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열， 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열， 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열， 개시 코 돈， 종결 코돈， 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 둥을 포함한다. 본 발명의 재조합 발현 백터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 백터라 면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며， 그 예로는 플라스미드 백터， 코즈미드 백터， 박테리오파아지 백터 및 바이러스 백터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드 (pUBllO 및 pTP5) 및 효모 유 래 플라스미드 (YEpl3, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며， 상기 바이러스는 레트로바이 러스， 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스， 배클로 바이러 스와 같은 곤충 바이러스 둥이 사용될 수 있으며， pcDNA 등을 사용할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 재조합 발현 백터는 PICP에 특이적으로 결합할 수 있는 CDR, VH와 VL 또는 중쇄와 경쇄의 구성을 갖는 항체를 암호화하는 폴리뉴클 레오티드가 적절한 숙주세포에서 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 유전자 작 제물을 의미한다. 바람직하게 본 발명에 따른 재조합 발현 백터는 서열번호 70， 서 열번호 74， 서열번호 78 및 서열번호 82로 이루어진 군에서 선택된 항체의 증쇄를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드， 그리고 서열번호 72, 서열번호 76, 서열번호 80 및 서열번호 84로 이루어진 군에서 선택된 항체의 경쇄를 암호화하 는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이다. 본 발명에 따른 항체를 제조하기 위해서는 다음과 같은 증쇄와 경쇄를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 쌍이 발현되도록 하는 것이 가장 바람직하다: 서열번호 70과 서열번호 72， 서열번호 74와 서열번호 76， 서열번호 78과 서열번호 80， 그리고 서열번호 82와서열번호 84 본 발명에 따른 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 각각 별개의 재조합 발현 백터에 포함되어 있을 수도 있고， 하나의 재조합 발현 백터에 포함되어 있을 수도 있다.

또한 본 발명에 따른 재조합 발현 백터는 scFv를 암호화하는 서열번호 66 또는 서열번호 68로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 또는 서열번호 58 및 서열번호 60으로 표시되는 염기서열 또는 서열 번호 62 및 서열번호 64로 표시되는 염기서열을 포함하는， Fab를 암호화하는 폴리뉴 클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오 티드를 포함하는 재조합 발현 백터로 형질전환된 세포를 제공한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 재조합 발현 백터에 포함된 항체 또는 그 단편 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 재조합 발현 백터로 형질전환된 세포 (숙 주세포)는 원핵생물 (예를 들어， 대장균), 진핵생물 (예를 들어， 효모 또는 다른 균류)， 식물 세포 (예를 들어， 담배 또는 토마토 식물 세포)， 동물 세포 (예를 들어, 인간 세 포， 원숭이 세포， 햄스터 (hamster) 세포， 랫 세포 (rat cell), 마우스 세포 (mouse cell), 곤층 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다. 예를 들어， HEK293F 세포 둥을 이용 할 수 있다. 본 발명에 따른 PICP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 폴리펩티 드를 발현할 수 있는 재조합 발현 백터는 당업계에 공지된 방법， 예를 들어 이에 한 정되지는 않으나， 일시적 형질감염 (transient transfection), 미세주사， 형질도입 (transduction)， 세포융합， 칼슘 포스페이트 침전법， 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 텍스트란—매개된 형질감염 (DEAE dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated transfection), 전기천공법 (dectroporation), 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 핵산 을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여.형질전환할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 백터로 형 질전환된 세포는 본 발명에 따른 항체의 중쇄， 경쇄 또는 항체의 단편을 생산하게 된다. 본 발명은 또한

(a) 본 발명에 따른 재조합 발현 백터로 숙주세포를 형질전환하는 단계;

(b) 형질전환된 숙주세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하는 단 계; 및

(c) 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함하는 PICP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법을 제공한다.

(a) 단계는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 생산하기 위하여 숙주세포 를 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현 백터로 형질전환하는 단계이다. ,

통상의 기술자는 선택된 숙주세포와 재조합 발현 백터에 따라 앞서 서술한 바와 같이 적절한 형질전환 방법을 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 가장 바람 직하게는 서열번호 70과 서열번호 72; 서열번호 74와 서열번호 76; 서열번호 78과 서열번호 80; 또는 서열번호 82와 서열번호 84로 표시되는 증쇄와 경쇄를 암호화하 는 염기서열의 쌍올 포함하는 재조합 발현 백터 중에서 선택하여 숙주세포를 형질 전환시킨다. 선택된 염기서열의 쌍에서， 중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 백터는 동일한 숙주세포에 공동형질전환하여 중쇄와 경쇄가 하나의 세포에서 발현되도록 할 수도 있고， 증쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 백터를 각각 별개의 숙주세포에 형질전환하여 중쇄와 경쇄가 따로 발현되도록 할 수도 있 다.

(b) 단계는 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 백터로부터 본 발명에 따른 항체의 증쇄， 경쇄 또는 항체의 단편의 폴리펩티드 가 생산되도록 하는 단계이다.

상기 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건， 배양 시간 등은 당 업계에서 통상 사용되는 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 숙주세포에서 생산 되는 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나， 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나， 페리플라즘 등으로 표적화 (targeted)되도록 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체가 PICP에 대한 결합특이성을 유지하도록 당압 계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩 (refolding)시키고 기능성 구조 (conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 또한 ¾G 형태의 항체를 생산하는 경우， 증쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 증쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고， 증쇄와 경쇄를 동일한 세포 에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다.

(c) 단계는 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계이다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩타이드의 특성， 숙주세포의 특성， 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 둥을 고려하여 통상의 기술자는 수 득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어， 배양 배지로 분비된 항체 또 는 그 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고， 원심분리하여 불순물을 제거하는 둥의 방법으로 항체를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포 질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 그 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득 한 항체는 크로마토그래피， 필터 둥에 의한 여과， 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다. 본 발명은 또한

(i) 세포 외 분비를 촉진하는 시그널 펩티드와 표지 단백질이 접합된 PICP αΐ 사슬과 PICP α2사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조 합 발현 백터를 제조하는 단계;

(ii) PICP αΐ 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발 현 백터와 PICP o2 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발 현 백터를 혼합하여 세포를 공동형질전환 (co-transfection)하는 단계;

(iii) 상기 공동형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및

(iv) 상기 세포에서 생성된 PICP 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 재 조합 PICP 단백질의 제조방법을 제공한다. 본 발명자들은 단백질 삼증 복합체인 PICP에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하기 위한 항원으로 재조합 HCP 단백질을 성공적으로 제조하였다. PICP를 구 성하는 프로콜라겐 αΐ와 α2 사슬 폴리펩티드를 동일한 세포에서 공동발현 (co expression)함으로써 자연 상태의 PICP와 동일하게 2:1의 -비을로 이종삼량체 (heterotrimer)를 형성하는 것을 확인하고， PICP 단백질을 고순도， 고수율로 수득할 수 있는 향상된 재조합 PICP 단백질의 제조 방법을 제공한다.

PICP는 세 가지 단백질의 복합체로 이루어져 있고， 자연 상태에서는 프로콜 라겐으로부터 프로테아제 작용으로 절단되어 생성되는 단백질이기 때문에， 재조합 단백질로 제작되었을 때 자연 상태에서와 같은 폴리펩티드의 구성으로 유사한 입체 구조를 형성할 수 있는지 예측하기 어렵다. PICP가 단독으로 재조합 단백질로 발현 -을ᅳ하도한 예나 PICP의 정확한 .입체 구조도 보고된 바 없다. - ^ —— 현재까지 주요한 PICP 단백질 수득 방법은 세포나 체내에서 자연 생성된 PICP를 분리정제하는 것이었다. 또한 PICP를 분리하는 데 있어서, PICP와 크기와 구조가 매우 유사하고， 체내에서 PICP 다음으로 높은 수준으로 존재하는 PIIICP의 오염을 제거하는 것이 어려운 점이었다. 이에 PICP와 PIIICP의 mannose rich oligosaccharide side chain의 차이를 이용한 정제 방법， PICP procollagen을 먼저 분 리하고 재조합 효소로 PICP를 절단하는 방법， 콜라겐을 높은 수준으로 발현하는 인 간 섬유아세포 (fibroblast) 둥의 배양 상둥액에 분비된 PICP를 수득하는 방법 등이 제안되었다. 그러나 이 같은 방법은 박테리아에서 제조한 재조합 PICP 절단 효소의 정확성이 떨어져서 PICP 말단에 변이가 발생하거나， PICP 수율이 매우 낮은 등의 문제점이 많았다. 본 발명에서 '단백질'은 '폴리펩타이드 (polypeptide)' 또는 '펩타이드 (peptide)'와 호환성 있게 사용되며， 예컨대， 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발 견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 또한 '단편 (fragment)'는 단백 질의 일부를 의미한다. 본 발명에서 '폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)' 또는 '핵산 '은 단일 -또는 이 중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 리보뉴클레오티드 (RNA) 를 말한다. 다른 제한이 없는 한， 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법 으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 폴리펩티 드를 형성하는 리보솜으로 전달하는 RNA이다. 본 발명에 따른 재조합 PICP 단백질 제조방법의 (i) 단계는 세포 외 분비를 촉진하는 시그널 펩티드와 표지 단백질이 접합된 PICP αΐ 사슬과 PICP α2 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 제조하는 단계이다. 상기 PICP αΐ 사슬과 PICP α2 사슬은 각각 프로콜라겐 αΐ 사슬과 α2 사슬 에서 PICP를 구성하는 부분에 해당하는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 재조합 발현 백터란 구체적으로는 적합한 숙주세포에서 재조합 PICP 단백질이 합성되고， 세포 와부 (즉세포 배양액으로)로 분비될 수 있도록， 세포 외 분비를 촉진하는 시그널 펩 티드 (신호 펩티드) 및 표지 단백질이 접합된 PICP αΐ 사슬과 PICP α2사슬을 암호 화하는 폴리뉴클레오티드가 발현조절서열 둥 필수적인 조절 요소가 작동가능하게 연결된 유전자 작제물을 의미한다. 상기 표지 단백질은 PICP αΐ 사슬과 α2사슬 단 백질의 검출이나 분리에 유용한 것이라면 공지된 표지 단백질을 제한 없이 사용할 수 있으며， 예를 들어 His, C-myc 등을 사용할 수 있다. PICP αΐ 사슬과 α2 사슬 단백질은 각각 다른 종류의 표지 단백질과 접합되는 것이 바람직하다. 또한 PICP α 1 사슬과 α2 사슬 단백질은 세포 배양액에서 용이하게 수득할 수 있도록 세포 외 분비를 유도하는 시그널 펩티드와 접합시키며， 예를 들어 murine Ig k-chain V-J2-C signal peptide 등을 사용할 수 있다. 상기 (i) 단계의 세포 외 분비를 촉진 하는 시그널 펩타이드와 표지 단백질이 접합된 PICP α 사슬 단백질의 구체적인 예 로서， Ν—말단에 murine Ig k-chain V-J2— C signal peptide 및 His(PICP al 사슬) 또는 C-myc tag(PICP o2 사슬)을 포함하는 PICP αΐ 사슬과 α2 사슬 단백질의 아 미노산 서열은 각각 서열번호 111과 서열번호 112에 기재되어 있다. 당해 분야의 통 상의 기술자는 공지의 유전자 재조합 기술을 이용하여 상기 시그널 펩티드와 표지 단백질이 접합된 PICP사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 재조 합 발현 백터를 제작할 수 있다ᅳ

상기 PICP αΐ 사슬과 α2 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며， 가장 바람직하게는 각각 서 열번호 86과 서열번호 88로 표시되는 염기서열을 포 하는 것일 수 있다. 상기 염기 서열에 의하여 암호화되는 PICP αΐ 사슬과 α2사슬의 아미노산 서열은 각각 서열번 호 85와 서열번호 87에 기재되어 있다. 상기 (i) 단계에서 제작한 재조합 발현 백터는 (ii) 단계에서 숙주세포에 공동 형질전환된다.

(i) 단계에서 제조된 PICP αΐ 사슬과 α2 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티 드를 포함하는 재조합 발현 백터는 2:1의 몰비 (molar ratio), 즉 PICP αΐ 사슬의 재 조합발현 백터 2 분자당 PICP αΐ 사슬의 재조합 발현 백터가 1분자가 되도록 혼합 하여 동시에 숙주세포에 도입되도록 하는 것이 바람직하다. 동일한 숙주세포에서 발 현된 PICP αΐ 사슬과 α2 사슬 단백질은 2:1의 구성비로 결합하여 PICP 단백질을 형 성하게 된다. 숙주세포의 형질전환은 당업계에 공지된 세포 내 폴리뉴클레오티드 전달 방 법을 적절하게 선택하여 실시할 수 있다. 예를 들어， 생체외 형질감염， 주입 또는 미 량주입 방법, 전기천공법 (dectroporation), 열층격법 (heat shock), 원형질 융합, 인산 칼슘 (CaP0₄) 침전법， 염화칼슘 (CaCk) 침전법， 실리콘 탄화물 위스커 (silicon carbide whiskers), 탄화규소 섬유와 함께 진탕처리， 초음파 처리 (sonication), 리포좀을 이용 한 형질감염, 수용체 매개 형질감염， 아그로박테리아 (Agrobacteria) 매개된 형질전환， 폴리에틸글리콜 (polyethylenglycol)에 의한 침전법, 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine) 또는 덱스트란 설페이트를 이용한 방법， 리포펙타민， 미세입자 층격， 입자 총 충격법 (particle gun bombardment) 둥의 방법이 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다.

(iii) 단계는 공동형질전환된 세포를 재조합 PICP 단백질을 생성하는 데 충분 한 시간 동안 배양하는 단계이다.

통상의 기술자는 재조합 PICP의 발현에 층분한 식간과 배양 조건을 적절히 선택할 수 있다. 배양 단계에서 시간대 별로 PICP 단백질을 검출하여 합성 효을을 확인할 수 있다.

(iv) 단계에서는 공동형질전환된 세포에서 생성된 재조합 PICP 단백질올 수 득한다.

숙주세포의 특성， 재조합 발현 백터의 발현 방식 (예흩 들어 프로모터의 특 성)， 폴리펩티드의 표적화 여부， 세포 외부 분비 등을 고려하여 통상의 기술자는 숙 주세포에서 생성된 재조합 단백질의 수득 방법을 적절히 선택하고 최적화할 수 있 다. (i) 단계에서 접합한 세포 외 분비 시그널 펩티드에 의해 배양 배지로 분비된 재 조합 단백질은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고， 원심분리하여 불순물을 제거하 는 둥의 방법으로 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 잔류하는 재조합 단백질을 회수하기 위하여 단백질와 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 방법으로 세포를 용해할 수도 있다. 또한 수득한 재조합 단백질은 크로마토그 래피， 필터 둥에 의한 여과， 투석 둥의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하 는 과정을 추가로 거칠 수 있다. 이와 같이 PICP 단백질을 유전자 재조합 기술로 생산하게 되면， 분리된 프로 콜라겐을 재조합 효소로 처리할 경우 효소의^' 이상 활성으로부터 발생할 수 있는 PICP의 변이의 문제점을 예방할 수 있고， 재조합 PICP 단백질에 특정 tag올 결합시 켜 다른 오염 물질 없이 고순도의 단백질 산물을 용이하게 수득할 수 있으며， 자연 생성된 PICP 단백질을 수득하는 것보다 월등한 수을을 얻을 수 있다.

【발명의 효과】 본 발명의 방법을 이용하여 단백질 복합체인 PICP를 용이하게 고순도 고수 율로 제조할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 PICP에 대한 결합 친화력과 결합특이성이 매우 높고 유사한 폴리펩티드에 대한 교차반웅성이 없으며， 항원 인식과 결합에 중요한 부위의 아미노산 서열이 특정되어 있어 용이하게 항체 를 반복하여 대량 생산할 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 재조합 PICP 항원을 발현하기 위한 예비 실험 결과를 나타낸다. 도 1A는 leucine zipper 도메인을 도입한 PICP αΐ 사슬의 모식도를 나타낸다. 도 1B는 leucine zipper도메인을 추가한 PICP αΐ 사슬을 포함하는 PICP 항원의 발현 경향을 확인하기 위한 쿠마시 염색한 SDS-PAGE 젤 사진을 나타낸다. 젤 사진에서 사각형 으로 표시한 부분이 단백질 복합체로 예상되는 밴드를 나타낸다. 도면에서 LZ는 leucine zipper이고， M은 마커를 나타낸다. F는 단백질과 결합한 resin을 column에 로딩하면서 용출된 버퍼이고 W는 column washing으로 용출된 버퍼를 나타낸다. 도 2는 재조합 PICP 항원을 발현하기 위한 재조합 발현 백터의 모식도를 나 타낸다. Pcmv는 프로모터， SP는 signal peptide (murine Ig K-chain V一 J2一 C signal peptide)이다.

도 3은 HEK293F 세포에서 발현시킨 재조합 PICP 항원 단백질을 확인하는 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다.

도 4는 HEK293F 세포에서 발현시킨 재조합 PICP 항원 단백질훌 확인하는 SDS— CGE와 Bioanalyzer분석 결과를 나타낸다. 도 4A는 재조합 PICP 또는 PIIICP 단백질의 SDS-CGE 결과이다. 도 4B는 마커 (ladder)의 SDS—CGE와 Bioanalyzer 결 과를 나타낸다. 도 4C와 도 4D는 각각 PICP와 PIIICP의 비환원 (Non— reducing) 또는 환원 (Reducing) 조건에서의 Bioanalyzer분석 결과를 나타낸다.

도 5는 재조합 PICP에 특이적으로 결합하는 scFv를 선별하기 위한 indirect -ELISA 과를 나타낸다. 도 5A는 PICP를 이용한 ELISA의 신호와 ΡΠΙΡ를 이용한 ELISA의 신호의 .비율 (ratio of O.D. 450nm; PICP/PIIICP)을 나타낸다. 도 5B는 PICP를 이용한 ELISA의 신호와 항원 없는 대조군 ELISA의 신호의 비율 (PICP/control)을 나타낸다. 도 5C는 PIIICP를 이용한 ELISA의 신호와 항원 없는 대조군 ELISA의 신호의 비율 (PniCP/control)을 나타낸다.

도 6은 2D와 4G scFv의 항원에 대한 결합친화력을 확인하기 위한 indirect ELISA 결과를 나타낸다. 도 6A는 PICP를， 도 6B는 PIIICP를 각각 항원으로 실시한 ELISA 결과를 나타낸다.

도 7은 293F 세포에서 발현시킨 2D와 4G IgG를 확인하기 위한 SDS— CGE와 Bioanalyzer 분석 결과를 나타낸다. 도 7A는 IgG의 SDS-CGE 결과이다. 도 7B는 마커 (ladder)의 SDS-CGE와 Bioanalyzer 결과를 나타낸다. 도 7C와 도 7D는 각각 2D와 4G G의 비환원 (Non-reducing) 또는 환원 (Reducing) 조건에서의 Bioanalyzer분석 결과를 나타낸다.

도 8은 2D와 4G IgG의 항원에 대한 결합친화력을 확인하기 위한 indirect ELISA 결과를 나타낸다. 도 8A는 PICP를， 도 8B는 PIIICP를 각각 항원으로 실시한 ELISA 결과를 나타낸다.

도 9는 2D, 4G, clone 1과 clone 2의 ¾G를 이용한 . sandwich ELISA 결과를 나타낸다. 도 9A는 PICP를， 도 9B는 PIIICP를 각각 항원으로 실시한 ELISA 결과이 다.

- 도 10은 2D ¾G를 이용한 sandwich ELISA의 표준 곡선을 나타낸다.

도 11은 2D ¾G의 PIIICP에 대한 교차반웅성을 확인하기 위한 sandwich ELISA 결과를 나타낸다.

도 12는 SPR 방법을 통하여 2D IgG의 PICP에 대한 결합력을 정량적으로 확인한 결과를 나타낸다.

도 13은 SPR 방법을 통하여 4G IgG의 PICP에 대한 결합력을 정량적으로 확인한 결과를 나타낸다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시 예께ᅳ한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

채조합 PICP 항워 제작

<1 1> 재조합 PICP 항원을 발현하기 위한 발현 백터 제작

PICP에 특이적인 항체를 제작하기 위한 항원 단백질로서 재조합 PICP 단백 질을 발현할 수 있는 발현 백터를 제작하였다. PICP를 구성하는 재조합 프로콜라겐 al 사슬 (PICP^Ql 사슬)과 ci2 사슬 (PICP α2 사슬)을 발현하기 위한 재조합 발현 백 터의 구조는 도 2에 나타낸 바와 같다. PICP 구성 단백질을 정제하고， 발현된 PICP 가 삼중합체 구조를 정확하게 이루었는지 확인하기 위하여 αΐ 사슬 Ν-말단에는 8xHis(histidine) tag을 접합하고， α2 사슬 Ν—말단에는 c_Myc tag을 접합하였다. 추 가적으로 N-말단에 단백질이 세포 외부로 분비되도록 유도하는 시그널 펩티드 (signal peptide, SP)인 murine Ig K-chain V-J2-C signal peptide를 접합시켰다. 시 그널 펩티드와 His 또는 Myc teg과 신호 펩티드가 접합된 αΐ 사슬과 α2 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 pSecTag2A 발현 백터에 삽입하였다. 상기 재조합 발현 백터를 제조하기 위하여 먼저 프로콜라겐 1형 αΐ과 α2 사 슬의 유전자를 포함하는 백터에서 PICP 부분을 PCR을 이용하여 증폭하였다. PICP aL:사슬 유전자는 다음의 프라이머를 이용하여 하나의 PCR 산물로 증폭하였다:

CAATGTGGTTCG-3' (정방향，^' 서열번호 91);

5' -TTGGGCCCTTACTACAGGAAGCAGACAGGGC-3' (역방향， 서열번호 92). PICP a2 사슬 유전자는 PICP a2 사슬을 N—말단 단편과 C-말단 단편의 두 부분으 로 -나누어 각각 증폭한 뒤， 중첩연장 PCR(overlap extension PCR)을 이용하여 각각 증폭된 두 부분이 연결되어 완전한 PICP α2 사슬의 유전자로 증폭되도록 하였다. PICP α2 유전자에는 클로닝에 사용될 Apal 제한효소의 인식 부위가 포함되어 있어 서 PICP^Q2 유전자를 증폭하기 위한 프라이머에 Apal 인식 부위를 없애기 위한 점 돌연변이를 도입하였다 (N—말단 단편 역방향 프라이머 볼드체로 표시한 아데닌). PICP α2 사슬 유전자를 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:

CCAGCCTCGCTCAG-3' (N-말단 단편， 정방향， 서열번호 93); 5' -GGATGTTTTCAGGTTGGGCACGGATACAGGTTTCGCC-3' (N-말단 단편， 역 방향， 서열번호 94); 5' -GCCCAACCTGAAAACATCC-3' (C—말단 단편， 정방향， 서 열번호 95); 5' -TTGGGCCCCTATTATTTGAAACAGACTGGGCCAATG-3' (C- ¾ 단 단편， 역방향， 서열번호 96). 중첩연장 PCR에는 N-말단 단편의 정방향 프라이머 (서열번호 93)와 C-말단 단편의 역방향 프라이머 (서열번호 96)를 이융하였다. 모든 프라이머는 마크로젠사 (한국)에 의뢰하여 제작하였다.

PICP αΐ 사슬의 유전자는 pfu 중합효소 (나노헬릭스， 한국)를 이용하여 중합 효소 연쇄반웅 (PCR)을 수행하여 제작하였다 (PCR 사이클: 95°C에서 30초， 53 °C에서 30초, 72°C에서 55초의 반웅을 30회 반복). PICP α2 사슬 유전자는 각각 증폭된 두 PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 아가로스 겔 정제 키트 (intron, 한 국)를 이용하여 정제 분리하고， 동일 PCR 조건에서 중첩연장 PCR을 실시하여 최종 적으로 PICP α2사슬 유전자 산물을 제작하였다.

상기 제조된 PICP αΐ과 α2 사슬의 PCR 산물은 동물 세포 발현 백터인 pSecTag2A 백터 (Invitrogen)에 Ascl/Apal 제한효소를 이용하여 삽입하여 pSecTag2A_rPICP alpha 1 백터와 pSecTag2A_PICP alpha2 백터를 제작하였다. 또한 PICP에 대한 비교 항원으로 PIIICP(procollagen type III C-terminal propeptide)를 발현하기 위한 백터도 유사한 방법으로 제작하였다.

- PIIICP는 PICP와 비교하여 구성 단백질이 비슷하고， 매우 유사한 이형 삼중 합체 구조를 형성할 뿐 아니라， 체내에서 PICP 다음으로 다량 존재한다. 따라서 PICP 항체의 특이성을 판단함에 있어 PIIICP와의 교차반웅성 (cross-reactivity)을 확 인해야 한다. PIIICP 단백질에는 His tag으로 접합되도록 하였다. PIIICP 유전자를 증폭하기 위하여 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:

AATGGATTTCAAAATC一 5' (정방향， 서열번호 ― 97),

3' -TTGGGCCCCTATTATAAAAAGCAAACAGGGCCAAC-5' (역방향， 서열번호 98).

<1-2> 재조합 PICP 항원 제작 효율을 위한 예비 실험

PICP는 프로콜라겐 1형 αΐ 사슬 2개와 프로콜라겐 1형 α2 사슬 한 개가 결 합한 단백질의 이종 삼중복합체 (heterotrimer)이며， 자연 상태에서는 프로콜라겐의 C一말단 부위가 절단되어서 생성되기 때문에， 재조합 단백질로 제작되었을 때 자연 상-태에서와 같은 항원성을 갖는 입체 구조를 형성할 수 있는지 예측하기 어렵다. 또 한 PICP가 단독으로 재조합 단백질로 제조된 예나 PICP의 정확한 3차원 구조도 보 고된 바 없다.

이에 따라， 프로콜라겐에서 PICP를 구성하는 폴리펩티드 부분 (이하 PICP αΐ 사슬 또는 PICP o2 사슬로 지칭)만을 재조합 단백질로 발현했을 때 정상적인 삼증 합체 구조를 형성하도록 leucine zipper(LZ) 도메인을 PICP αΐ 사슬에 도입하는 전 략을 시도하였다 (도 1A). LZ 도메인은 단백질 공학 분야에서 단백질의 이량체 (dimer) 또는 삼량체 (trimer)를 제작할 때 이용된다. PICP αΐ 사슬에 도입된 leucine zipper의 작용으로 먼저 PICP αΐ 사슬의 호모다이머의 형성이 촉진되고， 순차적으로 PICP αΐ 사슬 호모다이머에 PICP α2 사슬이 결합하여 PICP의 삼중합체를 형성할 것으로 예상하였다.

LZ 도메인을 도입한 PICP 재조합 단백질의 발현율을 알아보기 위하여， 실시 예 <1— 1〉에서 제작한 PICP αΐ 사슬을 포함하는 pSecTag2A-PICP alpha 1 백터에 GCN4 leucine zipper 도메인을 암호화하는 염기서열을 추가하여， PICP αΐ 사슬의 Ν-말단 부위에 상기 도메인이 접합되도록 하였다.

LZ를 포함하거나 포함하지 않는 pSecTag2A— PICP alpha 1 백터와 pSecTag2A-PICP alpha2 백터를 2:1의 몰비 (molar ratio)로 혼합하고， HEK293F 세 포에 공동형질전환 (CO— transfection)하였다. 형질전환한 세포는 7일 동안 배양하고， 배양 상둥액을 수득하여 발현된 재조합 PICP를 Ni/NTA resin(GE, 미국)을 이용하 여 정제하였다. Ni/NTA resin은 상둥액 50ml 당 Ni/NTA resin 1.5ml이 되도록 첨 가하여 50ml 튜브에서 균일하게 혼합하고， 이미다졸 (최종 농도 10mM)을 첨가한 후， 4^°C„에서 1사간 30분간 4rpm으로 회전시켜 resin에 PICP를 고정시켰다. 컬럼을 이미 다졸 (20mM)올 포함하는 PBS(20mM 포스페이트， 137mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4, 20mM 이미다졸) 50ml로 세척한 후， 이미다졸 (250mM)올 포함하는 PBS(20mM 포스페이트, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4, 250mM 이미다졸)로 용출하였다. 용 출된 분획물은 비환원 조건에서 SDS-PAGE에 전기영동하고， 쿠마시 염색하여 단백 질 발현 경향을 확인하였다. PIIICP도 동일한 방법으로 발현， 분리정제하였다. 도 1B와 표 1에서 보여지는 바와 같이， leucine zipper 도메인을 접합한 PICP αΐ 사슬과 PICP α2 사슬을 발현시킨 세포 (PICP with LZ)에서는 예상과 달리^ᅭ단ᅳ백—질의 수득량이 적었으며， PICP 삼중합체로부^ 예상되는 단백질의 분자량으로 는 설명하기 힘든 단백질의 밴드들이 확인되었다. 오히려 leucine zipper를 포함하지 않은 PICP Ql 사슬과 PICP α2를 발현한 세포 (PICP without LZ)에서 PICP 삼중합 체로 예상되는 단백질이 높은 수준으로 발현되었다. 【표 1] 3ε菅 &빽 : m直을

<l-3> 재조합 PICP 항원의 발현 및 정제

실시예 <1— 2>에서 확인한 대로， LZ를 포함하지 않는 재조합 PICP αΐ과 α2 사슬을 암호화하는 염기서열을 포함하는 발현 백터를 동물 세포에서 발현시켜 재조 합 PICP 항원 단백질을 생산하고 정제하였다. pSecTag2A-PICP alpha 1 백터와 pSecTag2A-PICP alpha2 백터를 2:1의 몰 비 (molar ratio)로 혼합하고, HEK293F 세포에 공동형질전환 (co—transfection)하였다. 공동형질전환한 세포를 7일 동안 배양하고， 배양 상등액을 수득하여 실시예 <1-2> 와 동일한 방법으로 단백질을 분리정제하였다. PIIICP 단백질도 동일한 방법으로 발 현하고 분리정제하였다. 정제된 단백질의 크기와 순도를 환원 또는 비환원 조건의 SDS— PAGE와 웨스턴 블럿 (western blotting, 항 -His tag, 항 -c— Myc tag)을 이용하 여 분석하였다. 상기 방법으로 배양 상둥액에서 수득한 재조합 PICP 단백질의 수율은 배양 상등액 100ml 당 약 lmg으로， 기존에 보고된 자연 생성된 PICP 단백질을 수득하는 경우 보다 (I~3mg/1L) 수율이 훨씬 뛰어난 것으로 나타났다 (EP 0465104 Bl; US 5,698,407； Pedersen BJ et al., Clin Chem, 40(5):811一 816， 1994). 도 3에 나타나듯이， 환원 조건 (Reducing)에서 전기영동한 경우에는 재조합 PICP의 αΐ과 α2 사슬로 구성된 복합체의 결합이 해리되어 각각 His와 Myc 항체에 의하여 분자량 마커 35kDa 근처의 단일 단백질 밴드로 감지되었다. PICP αΐ 사슬에 포함된 His에 결합하는 항체를 이용한 웨스턴 블롯에서는 (IB: His) 35kDa 근처에서， PICP α2 사슬에 포함된 Myc에 결합하는 항체를 이용한 웨스턴 블롯에서는 (IB: c-Myc) 약 32kDa 근처에서 단일 밴드로 관찰되었다. PICP에 대한 비교항원으로 제 작한 PIIICP 또한 예상되는 분자량으로 발현되는 것을 확인하였다.

한편 비환원 조건 (Non— reducing)에서 전기영동한 경우에는 His 항체와 Myc 항체를 이용한 웨스턴 블롯에서 모두 118kDa 크기의 단일한 단백질 밴드가 감지되 어， PICP가 예상대로 삼중합체를 구성하고 있음을 확인하였다. 또한 도 4에서 보여지듯이， SDS-CGE(capillary gel electrophoresis)와 Bioanalyzer(Agilent 2100 Bioanalyzer)를 이용한 단백질 분석에서도 재조합 PICP 항 원이 예상과 부합하는 분자량을 갖는 단백질 (비환원 조건에서의 복합체， 118.9kDa; 환원 조건에서의 PICP αΐ 사슬， 43.6kDa; 환원 조건에서의 PICP α2 사슬， 37.4kDa) 로 발현된 것을 확인하였다. 구체적인 Bioanalyzer 분석 결과는 표 2에 기재한 바와 같다. 또한 단백질의 크기가 유사한 PICP αΐ와 α2 사슬의 농도 (아미노산 농도)가 각 각 전체의 67.5%와 30.5%로 나타나， PICP αΐ와 α2가 자연 상태와 마찬가지로 2:1의 비율로 PICP의 단백질 복합체를 구성하고 있음을 확인하였다.

【표 2]

¾¾ 단꽥질 Bioanalyzer분석 결과

<실시예 2>

scFv library스크리닝

<2-l> scFv phage 선별

<실시예 1>에서 제조한 재조합 PICP 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 scFv를 선별하기 위하여 HA tag으로 표지된 인간의 B 세포에서 유래한 scFv phage library를 이용한 phage display panning 실험을 실시하였다. 실시예에 사용한 phage library에 대해서는 대한민국 둥록특허 10— 0961392호에 기재되어 있다. lml의 IX PBS 용액을 포함하는 Immuno-튜브에 1~10 의 항원 단백질을 첨가하고 37°C , 200rpm으로 1시간 동안 반웅시켜 튜브 안쪽 표면에 항원을 코팅하 였다. 항원 용액을 따라내고 수돗물로 1회 세척하여 코팅되지 않은 항원을 제거하였 다. 항원 단백질과 phage간 비특이적 결합을 막기 위하여 immuno-튜브와 scFv library를 각각 3% 탈지유가 포함된 IX PBST(0.05% tween20을 포함하는 PBS)로 1시간 동안 상온에서 반웅시켰다. Immuno—튜브에서 탈지유를 제거한 후， scFv library를 첨가하여 37^°C , 150rpm으로 1시간 동안 반웅시켜 PICP 항원에 scFv phage가 결합하도록 하였다. 제 1형 프로콜라겐에 특이적으로 결합하는 scFv를 찾기 위하여 반웅액에 제 3형 프로콜라겐을 r¾ig 정도 첨가하였다. scFv phage를 류브에 서 반웅시킨 후， IX PBST로 2~5번 세척하여 결합하지 않은 scFv phage를 제거하 였다.

재조합 PICP 항원에 특이적으로 결합한 scFv phage는 상온에서 triethylamine(lOOmM) lml을 첨가하여 10분 이내에 분리해내고， Tris(lM, pH 7.4)로 중화시켰다. 여과한 phage scFv를 이 3<1으로 배양한 ER2537 .co/ 첨가하여 3 7^°C , 120rpm으로 1시간 30분 동안 배양하면서 감염시켰다. phage에 감염된 E.coli는 원 -심분리하여 배양 상층액을 일부 제거한 후 재분산하여 암피실린과 포도당 (2%)을 포함하는 지름 15cm의 아가로즈 플레이트에 도포하였다. 다음날 5ml SB 배지를 도 포하여 플레이트에서 자란 세포들을 모두 수득하고， glycerol(50%)올 전체 부피의 0.5배가 되도록 첨가하여 혼합하고 lml씩 분주하여 -80°C에 보관하였다 (scFv panning stock). 상기 제조한 stock 20μ1를 20ml SB 용액에 접종하여 배양하고， helper phage를 이용하여 다음 단계의 phage panning을 위한 scFv phage - library(lml)로 제작하였다. PICP 항원에 특이적인ᅵ scFv를 발현하는 phage를 분리하 기 위한 상기 과정을 2~3회 반복하였다.

<2-2> PICP에 특이적으로 결합하는 scFv 항체 선별

실시예 <2-1>에서 선별된 phage가 발현하는 scFv가 재조합 PICP 항원 단 백질에 특이적으로 결합하는지 PICP와 PIIICP를 항원으로 하는 indirect ELISA를 실시하여 조사하였다.

Panning을 3회 반복하여 수득한 scFv 결과물을 희석하여 지름 10cm의 아가 로즈 플레이트에 도포하고， 다음날 각각의 클론을 선별하여 200μ1의 SB 배지가 포함 된 96 well 플레이트에서 각각 배양하였다. 전체적으로 증식이 잘된 것올 확인하고， IPTG(lmM)를 첨가하고 30°C로 16시간 동안 배양하여 scFv의 생산을 유도하였다. 다음날 96 well 플레이트를 원심분리하여 세포만 분리한 뒤， TES 용액을 이용하여 세포를 용해시키고， 다시 원심분리하여 상층액만 분리하였다. 수득한 상층액으로 indirect ELISA를 실시하여 재조합 PICP 항원에 특이적으로 결합하는 scFv를 선별 하였다. 앞선 실시예에서 제조한 PICP 또는 PIIICP로 플레이트를 코팅하고， scFv를 포함하는 배양 상층액을 반응시킨 후， 2차 항체로 항 -HA— HRP 항체 (Roche Applied Science)와 반응시켰다 . Tetramethylbenzimidine(TMB, Thermo scientific)을 이용하 여 발색 반웅한 후， H2SO₄(lM)을 이용하여 발색 반웅을 증지시키고 ELISA reader 로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. PICP 항원을 이용한 실험에서 측정된 흡광도를 각각 PIIICP를 이용한 실험 또는 대조군의 실험에서 측정된 흡광도에 대한 비율 (PICP PIIICP또는 PICP/control)로 계산하고， scFv를 선별하는 지표로 하였다. 도 5에서 나타나듯이， 클론 2D， AG, 그리고 7E에서 발현된 scFv가 PIIICP에 비하여 높은 PICP 흡광도 수치를 나타내어 (도 5A, PICP/PIIICP), PICP와 PIIICP에 차별적으로 반웅하고， PICP 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 판단되었다. 이증 클론 7E의 scFv는 대조군에 대한 PICP흡광도 수치 (도 5B, PICP/control)가 상대적 으로 낮아 비특이적 반웅으로 인한 배경 신호 (background)가 높은 것으로 판단되었 다. 이에 PICP 특이적인 scFv를 생산하기 위한 phage 클론으로 2D와 4G를 선택하 였다.

<2-3> PICP에 특이적으로 결합하는 scFv 항체의 결합력 검증

클론 2D와 4G의 scFv의 항원결합력 (affinity)과 결합특이성 (specificity)을 indirect ELISA를 이용하여 알아보았다. 앞선 실시예에서 제조한 PICP와 PIIICP를 항원으로 하여 마이크로타이터 플 레이트에 각각 2yg/ml의 농도로 상온에서 1시간 동안 고정시키고， 2% 탈지유를 포 한하는 PBST로 상온에서 1시간 동안 블로킹 (blocking)하였다. 30~2000ng/ml의 범위 에서 순차적으로 희석된 클론 2D와 4G의 scFv (각각 2D scFv와 4G scFv로 지칭함) 를 블로킹된 플레이트에 웰당 ΙΟΟμΙ씩 첨가하고， 상온에서 1시간 동안 반웅시켰다. 2 차 항체로 항 HA-HRP 항체 (1:2,000)를 웰당 ΙΟΟμΙ씩 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반웅시켰다. 항체와 반웅한 마이크로타이터 플레이트는 PBST로 3~4번 세척한 후， ΤΜΒ 용액을 웰당 50μ1씩 첨가하여 상온에서 5~10분 동안 발색 반웅시킨 뒤， H₂SO₄(lM)로 반웅을 증지시키고， ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 6에서 확인할 수 있듯이， 2D와 4G scFv는 저농도에서도 PICP 항원에 민 감하게 결합하였으며， scFv의 농도 500ng/ml 이상에서는 반웅이 포화된 것으로 관 찰되었다 (도 6A). 4G scFv가 2D보다 PICP에 대한 항원결합력이 약간 강한 것으로 나타났다. 한편 2D와 4G scFv는 모두 PinCP에는 전혀 결합하지 않아 PICP에 대한 결합특이성이 매우 우수한 것으로 나타났다 (도 6B).

<2-4> scFv 항체의 IgG로의 전환

앞서 선별된 2D와 4G scFv를 보다 통상적으로 사용되는 항체인 IgG의 형태 로 변환시켰다. 먼저 클론 2D와 4G phage의 유전체에서 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티 드를 PCR로 증폭하였다. 2D와 4G scFv의 VH 영역의 유전자를 증폭하는데 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:

5 ' - AGAGAGTGTAC ACTCCC AGGCGGCCGAGGTGC AGCG-3 ' (정방향， 서열번호 99)； 5'-CGCCGCTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGCTCACGGTGACCAG-3' (역방 향， 서열번호 100). 2D와 4G 의 scFv의 VL 영역의 유전자를 증폭하는데 사용한 프 라이머의 염기서열은 다음과 같다: 5'-AAGCGGCCGCCACCA

ACTCCCAGTCTGTGCTGACTCAG-3 ' (정방향， 서열번호 101 )；

5'-CGCCGCCGTACGTAGGACCGTCAGCTTGGT-3' (역방향， 서열번호 102). 클론 2D 또는 4G phage DNA(50ng)를 주형으로 하여 상기 프라이머 (각각 lOpmol)를 이 용하여 95^°C/3min; 95^°C/30sec, 60^°C/30sec, 72^°C/30sec, 30 cycles; 72°C/5min의 조건 으로 PCR을 수행하여 2D 또는 4G scFv의 VH 또는 VL 유전자를 증폭하였다. PCR 산물은 제한효소를 이용하여 IgG 생산에 사용되는 백터인 pcDNA3.4 백터에 삽입하였다. ¾G의 중쇄 (heavy chain)와 경쇄 (light chain)의 단백질은 별개의 플라 스미드에서 개별적으로 발현되도록 하였다. 상기 제조된 2D 또는 4G scFv의 가변영역을 포함하는 IgG (이하 각각 2D ¾G와 4G IgG로 지칭)의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 백터는 freestyle 293F 세포에 공동형질전환시켜 경쇄와 중쇄가 세포 안에서 함께 발현되도 록 하였다. 형질전환된 293F 세포를 37^°C, 8% CO₂ 조건에서 7일 동안 배양하여 상 층액을 수득하였다. 상층액은 cellulose acetate membrane filter(pore size 0.22 m, Corning)로 여과하고 CaptivAlM PriMAB protein A column (Repligen, USA)을 사용 하여 정제하였다. 수득한 항체 농도는 BCA kit (Pierce, 23225)를 이용하여 측정하였 고， Bioanalyzer(Agilent 2100 Bioanalyzer)를 이용하여 환원과 비환원 조건에서 생산 된 ¾G 항체 단백질을 분석하였다.

【표 3】

IgG Bioanalyzer분석 ¾파

도 7에서 나타나듯이， 2D IgG와 4G IgG의 경쇄 (light chain)과 중쇄 (heavy chain)가 예상되는 분자량으로 모두 잘 발현되고 있는 것을 확인하였다. 구체적인 Bioanalyzer 분석 결과는 표 3에 나타낸 바와 같다. 비환원 조건에서 2D ¾G와 4G IgG는 각각 170.8kDa과 169.6kDa의 분자량을 갖는 것으로 나타났고， 환원 조건에서 는 2D IgG의 증쇄는 60.8kDa, 경쇄는 26.3kDa, 그리고 4G IgG의 증쇄는 62.0kDa, 경쇄는 26.8kDa의 분자량으로 관찰되었다. 또한 발현된 IgG의 중쇄의 농도 (아미노산 의 농도)는 경쇄의 대략 2배로 측정되어， 경쇄 보다 약 2배의 아미노산 서열올 갖는 중쇄가 경쇄와 1:1의 비율로 존재하는 것으로 나타났다. 즉， 두 분자의 중쇄가 두 분 자의 경쇄와 복합체를 형성하여 IgG를 구성하고 있음을 알 수 있었다.

<2-5> 전환된 ¾G의 PICP 결합력 검증 _ indirect ELISA

앞선 실시예에서 제조한 2D와 4G scFv의 가변영역을 포함하는 IgG의 항원 결합력 (affinity)과 결합특이성 (specificity)을 indirect ELISA를 이용하여 알아보았다.

<실시예 ι>에서 제조한 PICP와 PinCP 항원을 각각 2yg/ml의 농도로 마이 크로타이터 플레이트에 상온에서 1시간 동안 고정시키고， 2% 탈지유를 포함하는 IX PBST로 상온에서 1시간 동안 blocking하였다. 2D ¾G와 4G IgG를 15.625~1000ng/ml 범위에서 순차 회석하여 각각 blocking된 플레이트에 웰당 ΙΟΟμΙ 씩 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반웅시켰다. 2차 항체로 항 human IgG—HRP 항 체 (Millipore, 1:2,000)를 웰당 ΙΟΟμΙ씩 넣고 상온에서 1시간 동안 반웅시켰다. 반웅된 마이크로타이터 플레이트를 IX PBST로 3~4번 세척한 후， ΤΜΒ 용액을 웰당 50μ1 깩^{^} -첨―가하여， 상온에서 5~10분 동안 발색 반웅을 진행하였다. H₂S0₄(1M)을 이용하 여 발색 반웅을 중지시킨 후， ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 8에서 확인할 수 있듯이， 2D G와 4G IgG는 모두 저농도에서도 PICP 함 ¾에 민감하게 결합하는 것으로 관찰되었다 (도 8A). IgG의 경우에는 클론 2D의 가변영역을 포함하는 IgG가 4G보다 PICP에 대한 항원결합력이 높은 것으로 나타났 다. 한편 클론 2D와 4G의 가변영역을 포함하는 ¾G는 모두 PIIICP에는 전혀 결합하 지 않아 PICP에 대한 결합특이성이 매우 우수한 것으로 나타났다 (도 8B).

<2-6> 전환된 IgG의 PICP 결합력 검증 _ SPR

정제한 항체 단백질 (2D IgG 및 4G IgG)과 항원 (PICP)에 대한 정량적인 결 합력을 Biacore2000 SPRCSurface Plasmon Resonance) (GE healthcare, 미국) 바이오 센서를 이용하여 측정하였다. PICP 항원을 센서칩 (sensor chip CM5)(GE healthcare，미국)에 고정시킨 후， HES 완충용액 (10 mM HEPES, pH7.4 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20)에 순차적으로 희석한 항체 (6.25 ~ 100 nM) 단백질 을 3분 동안 30 ^/min속도로 홀려주고， 1M NaCl / 20mM NaOH를 3 분 동안 30 μί/ 속도로 홀려줌으로써 항원에 결합된 단백질 해리를 유도하였다. 구체적인 실험 조건은 다음과 같다;

Immobilized Antigen ： PICP

Immobilized level ： 185 RU

Antibody ： 2D IgG, 4G IgG,

Running buffer： HBS— EP buffer

Regeneration ： 2 M NaCl, 20 mM NaOH (flow 30 ul I min 1 min) binding concentration :2D, 4G = 100 nM→50 nM→ 25 nM→12.5 nM→ 6.25 nM

속도 상수와 평형 해리상수를 나타낸 것이다. BIA evaluation ver.3.2 소프트웨어를 이용하여 친화도를 운동속도 상수 (ka 및 kd)와 평형해리상수 (KD)로 얻었다.

도 12 및 도 13은 각각 2D IgG, 4G ¾G의 SPR 그래프 결과를 나타낸다. 이 로부터 상기 2D IgG, 4G IgG는 높은 PICP에 특이적으로 높은 결합력을 가짐을 확 인하였다.

<실시예 3>

Yeast Fab library 스크리닝

<3 1> Yeast Fab 선별

인간의 Fab를 발현하는 yeast Fab library를 스크리닝하여 〈실시예 1>에서 제조한 재조합 PICP 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 Fab를 발현하는 yeast clone을 스크리닝하였다.

Yeast Fab library에서 PICP 단백질에 특이적으로 결합하는 클론을 선별한 방법은 다음과 같다. 항원인 PICP 단백질과 유사 단백질인 PIIICP를 본 발명의 방 법으로 99% 이상의 순도로 준비하였다. PICP 단백질은 kit를 이용하여 바이오틴과 접합시켰다 (EZ-LINK^TMSulfo-NHS-LC-Biotinylationkit, Pierce Inc., USA)). 이후 구축된 라이브러리를 MACS 및 FACS를 이용하여 선별하고， 도출된 po이을 분석하 는 과정을 반복하였다. 이를 통해 항체 Fab의 발현 정도와 바이오틴화된 PICP(biotinylated PICP)에 대한 결합능을 분석할 수 있다.

바이오틴화된 PICP(500nM)를 효모 세포 표면에 발현된 Fab 라이브러리와 25^°C에서 1시간 동안 결합시켰다. PICP와 반웅한 Fab library를 Streptavidin-Microbead(Miltenyi Biotec Inc., Germany)와 4^°C에서 10분 간 결합시 킨 후 MACS (magnetic-activated cell sorting)를 이용하여 biotinylated PICP와 결합 한 클론들을 선별하였다. 다음으로， PICP를 효모 세포 표면에 발현된 Fab 라이브러 리와 25^°C에서 1시간 동안 결합시킨 후, PE가 접합된 streptavidin(Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate(SA-PE), Invitrogen)과 Alexa 488이 접합된 항 -IgG 항체 (goat Alexa 488-conjugated anti-Fc antibody, SIGMA-ALDRICH co., USA)를 4^°C에서 20분 동안 결합시킨 후 FACS (fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여 Fab의 발현량이 높고， biotinylated PICP와 결합력이 높은 클론을 선별하였다. 이후 동일한 방법으로 250ηΜ, ΙΟΟηΜ 농도의 biotinylated PICP를 이용하여 FACS 과정을 2회 반복하였다. 상기 2차， 3차 FACS 과정에서 biotinylated PICP의 경쟁 단백질로서 바이오틴과 접 합하지 않은 PICP를 2차 FACS 수행 시에는 10배， 3차 FACS 수행 시에는 20배 높 은농도로 경쟁시켜 PICP에 결합하는 개별 클론들을 선별하였다.

최종적으로 PICP에 특이적으로 결합하는 것으로 clone 1과 clone 2올 선별하 고， 각각의 효모 세포로부터 DNA를 수득하고 서열을 분석하여 Fab에 해당하는 염 기서열 및 아미노산 서열을 확인하였다.

<3-2> Fab의 IgG로의 전환

실시예 <3_1〉에서 선별된 clone 1과 clone 2 Fab를 IgG로 전환하고 동물세 포에서 발현하기 위하여， 상기 클론에서 분리한 DNA에서 Fab의 VH 와 VL를 암호 화하는 염기서열을 확인하여 클로닝하고， mouse IgG2a의 경쇄와 중쇄를 포함하는 pcDNA3.4 백터에 각각 삽입하였다. 구체적으로 VH 부분은 프라이머 (정방향 5' -AATGTACACTCCGAAGTGCAATTGGTGGAGTCTG-3' , 서열번호 103; 역방 향 5' -GACCGATGGGGCTGTTGTTTTGGCGGAAGAGACGGTAACC-3' , 서열번 호 104)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 마우스 IgG2a의 CHI, CH2, CH3를 포함하 는 백터로부터 프라이머 (정방향 5'-GCCAAAACAACAGCCCCATCGGTC-3', 서열 번호 105; 역방향 5'-ATATCCAAGCTTCTACTATTTACCCGGAGTCCGGGA G-3', 서열번호 106)로 PCR을 수행하여 중쇄 절편을 증폭하였다. 이후 서열번호 103， 서열번호 106의 프라이머를 사용하여 중첩연장 PCR을 수행하여 chimeric IgG2a의 증쇄 DNA를 제작하고， 적절한 제한효소로 처리하여 ¾G 생산에 사용되는 백터인 pcDNA3.4에 도입하였다.

VL 부분은 프라이머 (정방향 열번호 107; 역방향 5'-TTCGTACGCTTAATCTCCACCTTC-3', 서열번호 108)를 이용하여 PCR을 수행하여 절편을 증폭하였다. 마우스의 경쇄 kappa chain을 포함하 는 백터로부터 프라이머 (정방향

5'— CTTTTACATTCGGCCAGGGAACGAAGGTGGAGATTAAGCGT-3', 서열번호 109； 역방향 5'— ATCCAAGCTTCTACTAACACTCATTCCTGTTGAAG-3', 서열번 호 110)를 사용하여 경쇄 절편을 증폭하였다. 이후 서열번호 107， 서열번호 110와 프 라이.머를 사용하여 증첩연장 PCR을 수행하여 chimeric IgG2a의 경쇄 DNA를 제작 하고， 적절한 제한효소로 처리하여 IgG 생산에 사용되는 백터인 pcDNA3.4에 도입 하였다.

<3-3> 전환된 IgG의 PICP 결합력 검증

clone 1과 clone 2의 VH와 VL을 갖는 IgG(clone 1 IgG와 clone 2 IgG로 지 칭)의 PICP에 대한 결합특이성을 sandwich ELISA로 확인하였다 (도 9). sandwich ELISA의 항원으로 PICP와 PIIICP를 사용하였고， 앞선 실시예에서 제조한 2D IgG 와 4G IgG와 함깨 ELISA 반웅올 수행하여 새로 제조한 IgG의 결합친화력과 결합 특이성과 비교하였다.

2D, 4G, clone 1， clone 2 IgG antibody를 capture antibody로 하여 microtiter plate를 coating하고 항원으로 PICP와 PIIICP를 각각 농도별로 ΙΟΟμΙ씩 각 wel 넣 어 1시간 동안 반웅시켰다. IX PBST(0.05 Tween 20)로 세척하고， detection antibody(polyclonal PICP antibody)를 IX PBST에 희석하여 ΙΟΟμΙ씩 넣어 1시간 동 안 반웅시켰다. 다시 IX PBST로 세척하고， rabbit-HRP(millipore) antibody를 IX PBST에 희석하여 ΙΟΟμΙ씩 넣어 1시간 동안 반웅시켰다. IX PBST로세척한 후， TMB solution을 각 wel 50μ1씩 넣고 발색 반웅을 확인한 후， 2Ν stop solution(H₂S04)를 50μ1씩 넣어서 반응을 중지시켰다. ELISA reader기를 이용하여 450nm파장에서 흡광도를 측정하였다 (reference 620nm). 도 9의 결과에서 확인할 수 있듯이， clone 1 IgG와 clone 2 ¾G도 PICP에 대 하여 민감하게 반웅하였으며， 앞서 선별된 4G IgG와 2D IgG와 비교하여 PICP에 대 한 결합친화력은 다소 낮은 것으로 나타났다 (도 9A). IgG 항체 중 2D IgG가 항원 결합력이 가장 우수하였다. 또한 clone 1 IgG와 clone 2 IgG 모두 PIIICP에 대하여 서는 전혀 결합하지 않아， PICP에 대한 결합특이성이 매우 뛰어난 것으로 확인되었 다 (도 9B).

<실시예 4>

IgG를 이용한 ELISA 효율

선별된 IgG 항체 중 항원결합력이 가장 높은 2D IgG로 추가적으로 sandwich ELISA를 실시하고 ELISA 효을올 알아보았다.

2D G를 16yg/ml 농도로 2시간 동안 상온에서 마이크로타이터 (96 well) 플 레이트에 고정하고， 1% BSA를 포함하는 IX PBST를 웰당 300μ1씩 첨가하여 상온 에서 30분 blocking하였다. IX PBST 200μ1로 3번씩 세척하고， 2% sucrose를 웰당 200μ1씩 첨가하여 10분 동안 안정화하였다. 10분 후 sucrose 용액을 따라내고， 상온 에서 10분 동안 건조시킨다. PICP 항원 또는 농도를 측정할 샘플을 IX PBST에 농 도별로 회석하여 웰당 ΙΟΟμΙ씩 첨가하여 상온에서 30분 동안 반웅시켰다. 반웅 용액 을 제거하고， 감지 항체 (detection antibody)로 rabbit 항 -PICP 항체를 2yg/ml의 농 도로 웰당 ΙΟΟμΙ씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 반웅시켰다. 2차 항체로 goat 항 -rabbit IgG-HRP(Millipore) 항체를 웰당 ΙΟΟμΙ씩 첨가하여 상은에서 1시간 동안 반 웅시켰다. IX PBST로 4번 세척하고， TMB 용액을 웰당 50μ1씩 첨가하여 상온에서 5~15분 동안 발색 반웅을 진행하였다. H₂SO₄(2N)를 웰당 50μ1 첨가하여 발색 반웅을 중지하고， ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 4-parameter 방식으로 농도로 전환하여 표준 용액 (standard)과 샘플의 농도를 확인 하였다. 도 10에 PICP 항원의 농도에 따른 흡광도를 나타낸 표준 곡선 (standard curve)을 도시하였다. 표준 곡선에 사용된 흡광도 측정치는 표 5에， 표준 곡선에 따 라 환산된 PICP와 관련 데이터는 표 6에 각각 기재한 바와 같다. 2D IgG를 이용한 ELISA의 검출한계 (limit of detection, IOD)는 lng/ml인 것으로 확인되었다. 정확 도 (accuracy)는 항원 농도별로 측정한 변동계수 (coefficient of variation, CV)가 20% 이하인 것으로， 그리고 recovery는 8(Γ120% 범위인 것으로 확인되었다. 또한 도 11에 나타난 바와 같이， 2D IgG는 PIIICP에는 전혀 결합하지 않아 PIIICP에 교차반웅성 (cross-reactivity)도 없는 것으로 확인되었다.

【표 5】

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【산업상 이용가능성】

이상 살펴본 바와 같이， 본 발명을 이용하여 단백질 복합체인 PICP를 용이하게 고 순도 고수율로 제조하고 이에 특이적인 항체를 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항 체와 방법 등은 PICP를 감지하여 콜라겐 합성이나 콜라겐 관련 대사 작용을 확인하 기 위한 의약용， 화장품 효능 측정용 등 다양한 용도의 PICP 검출용 키트 또는 진 단 시약을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.