등온증폭 및 형광 링 패턴에 기반한 표적 핵산의 다중 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법

본 발명은 우수한 민감도와 특이성으로 신속하고 간편하게 병원체의 다중검출이 가능한 유전자 검사 플랫폼 기술에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 회전환 증폭 반응, 및 증폭 산물 내 표적 핵산 서열과 캡처 DNA-형광 물질의 결합반응이 동시에 일어나며, 이를 통해 생성된 반응 용액의 형광 링 패턴 형성 여부를 통해 표적 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 표적 핵산과 상보적인 핵산서열을 포함하는 프로브 (probe);

회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA)을 위한 프라이머 (primer); 및

캡처 DNA의 말단에 결합된 형광 물질을 포함하는, 표적 핵산 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 검출용 조성물은 리가아제 (ligase) 및 DNA 중합효소를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "표적 핵산"은 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 서로 다른 종 (species), 아종 (subspecies), 또는 변종 (variant) 유래의 유전자 염기서열 또는 동일한 종 내 유전자 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 핵산은 genomic DNA, mitochondrial DNA, viral DNA를 포함하는 모든 종류의 DNA, 및 mRNA, ribosomal RNA, non-coding RNA, tRNA, viral RNA 등을 포함하는 모든 종류의 RNA일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 표적은 바람직하게 박테리아 (Bacteria), 바이러스 (Virus) 또는 진균 (Fungus)일 수 있으며, 더욱 바람직하게 상기 박테리아는 메티실린 내성 포도상구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA)일 수 있고, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프로브 (Probe)"란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기 길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 프로브는 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 검출하고자 하는 표적 핵산과 상보적인 핵산서열을 포함하여 상기 표적 핵산에 특이적으로 결합할 수 있으며, 표적 핵산과 상보적으로 결합하는 부위에 닉 (nick)을 포함한다. 표적 핵산이 프로브와 상보적으로 결합하면 상기 프로브의 열려있는 부분인 닉의 5' 말단과 3' 말단이 인접하게 되고, 연결 효소 (ligase)에 의해 연결되어 환형을 이루게 된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "상보적인"은 2개의 뉴클레오티드 사이의 정확한 쌍형성에 대한 능력을 지칭한다. 즉, 핵산의 주어진 위치에서 뉴클레오티드가 다른 핵산의 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 있다면, 2개의 핵산은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미칠 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 리가아제는 바람직하게 T4 리가아제일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니며 상기 T4 리가아제와 같이 상기 프로브의 닉 부분을 연결하는 기능을 갖는 것이라면 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머 (primer)"란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로서, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 표적 핵산이 프로브에 결합하면 프로브가 연결되어 환형의 주형을 형성하게 되고 DNA 중합효소가 상기 프라이머를 기시점으로 하여 회전환 증폭이 유도될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "회전환 증폭 (rolling circle amplification; RCA)"이란 롤링 서클 메커니즘을 통한 원형 핵산 주형을 증폭하는 핵산 증폭 반응을 의미한다. 회전환 증폭 반응은 원형의, 흔히 단일 가닥인 핵산 주형에 대한 프라이머의 혼성화에 의해 개시된다. 다음으로, 핵산 중합효소는 원형 핵산 주형 주위로 계속하여 진행함으로써 원형 핵산 주형에 혼성화된 프라이머를 확장하여 핵산 주형의 서열을 반복하여 복제한다. 회전환 증폭은 원형 핵산 주형 서열의 탠덤 (tandem) 반복 유닛을 포함하는 콘카테머를 통상적으로 생성한다. 회전환 증폭은 선형 증폭 동역학을 나타내는 선형 RCA (LRCA)(예컨대, 단일 특이적 프라이머를 사용한 RCA)일 수 있거나, 또는 지수형 증폭 동역학을 나타내는 지수형 RCA (ERCA)일 수 있다. 회전환 증폭은 또한, 과분지된 콘카테머를 생성하도록 복수의 프라이머를 사용하여 수행될 수도 있다(복수회 프라이밍된 롤링 서클 증폭 또는 MPRCA). 예컨대, 이중 프라이밍된 RCA에서, 하나의 프라이머는 선형 RCA에서와 같이 원형 핵산 주형에 상보적일 수 있는 반면, 다른 프라이머는 RCA 생성물의 탠덤 반복 유닛 핵산 서열에 상보적일 수 있다. 회전환 증폭은 이에 적합한 DNA 중합효소를 사용하여 등온 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 발명에 있어서, 회전환 증폭을 통해 생성된 산물은 하나 이상의 표적 핵산 서열 및 공간적 구조적 여유가 있는 반복 서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 DNA일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 회전환 증폭에 적합한 phi29 DNA 중합효소일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니며 상기 프로브의 핵산서열을 주형으로 하여 회전환 증폭을 수행할 수 있는 기능을 갖는 것이라면 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 형광 물질은 하나의 캡처 DNA의 말단에 결합되어 있는 것으로, 상기 캡처 DNA는 상기 회전환 증폭 결과 생성되는 긴 단일 가닥의 DNA 내 표적 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있다.

상기 형광 물질은 서로 다른 파장대의 것이라면 하나 이상의 것을 동시에 이용할 수 있으며, 바람직하게는 플루오레신 (fluorescein; FAM), 텍사스레드 (TexasRed), 로다민 (rhodamine), 알렉사 (alexa), 시아닌 (cyanine; Cy), 보디피 (BODIPY), 아세톡시메틸 에스터 (Acetoxymethyl ester), 쿠마린 (coumarin) 및 양자점 (quantum dot)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 캡처 DNA 핵산 가닥에 부착이 가능한 공지의 형광을 발생하는 물질이라면 모두 사용 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 형광 물질은 300 내지 800 nm, 300 내지 700 nm, 300 내지 650 nm, 400 내지 800 nm, 400 내지 700 nm, 400 내지 650 nm, 450 내지 800 nm, 450 내지 700 nm 또는 450 내지 650 nm의 방출(emission) 파장을 갖는 것일 수 있다.

상기 형광 물질이 300 nm 미만 또는 800 nm 초과의 방출 파장을 갖는 경우, 형광 링 패턴이 구분되지 않을 수 있다.

본 발명에서는 구체적인 실시예에서 본 발명에 따른 검출법은 액적이 형성하는 형광 링 패턴의 모양을 관찰함으로써 하나 이상의 표적 핵산을 간편하고도 높은 정확도로 검출 가능함을 확인하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 일 실시예에서는, 다양한 기공 크기를 가지는 종이 필터 상에 등온 증폭 산물과 캡쳐 DNA-형광 물질의 응집물을 떨어뜨린 결과, 더 작고 균일한 기공을 가질수록 액적의 중앙에서 더 강한 형광 신호가 나타나는 것을 확인하였다 (실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 검출법의 형광 여기(excitation) 파장, 증폭 배양 시간 및 온도 조건을 다르게 하여 증폭 산물-캡쳐 DNA 형광 물질이 형성하는 액적의 패턴을 확인한 결과, 254 nm 파장에서 더 뚜렷하게 링 패턴이 억제되어 액적의 중앙에 밀집한 형광 신호를 얻을 수 있었으며, 5분 이상의 증폭 배양 시간으로도 형광 링 패턴이 변화함을 관찰할 수 있었고, 증폭 배양 온도는 37℃가 가장 적합함을 확인하였다 (실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 표적 유전자 핵산의 농도를 달리하여 각각 처리한 조건에서 등온증폭 반응 및 증폭 산물의 표적 핵산과 캡처 DNA-형광 물질의 결합 반응에 의해 형성된 응집물을 Cellulose Nitrate 필터 종이 위에 떨어뜨린 결과, 형광 링 패턴의 형성이 억제되었으며 표적 유전자 핵산의 농도가 높아질수록 원의 중앙에 위치하는 형광의 신호가 강해지는 것을 확인하였다 (실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 표적 유전자 물질이 단독으로 존재하지 않아도 선택적으로 검출이 가능한지 확인하기 위해 SARS-CoV-2 유래 RBD 및 RdRp 유전자, 메티실린 내성 포도상구균 유래 mecA 유전자를 한 개 내지 3개 조합으로 처리하고 RBD 유전자를 표적 핵산으로 하여 이에 대한 캡처 DNA-형광 물질을 이용해 분석을 진행한 결과, RBD 유전자가 처리된 조건에서만 원의 중앙에 밀집한 형광 신호를 관찰할 수 있었으며, 처리되지 않은 조건에서는 원의 가장자리에서 형광 신호를 보여 형광 링 패턴을 형성한 것으로 나타나 표적 핵산 첨가에 의한 형광 링 패턴 억제 현상의 선택성을 확인하였다 (실시예 5 참조).

본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산은 복수 개일 수 있다. 구체적으로, 표적 핵산이 복수 개, 즉, 2개 이상인 경우, 상기 검출용 조성물은 각각의 표적 핵산에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 프로브들, 상기 각각의 프로브에 대한 프라이머들, 상기 각각의 표적 핵산의 회전환 증폭 산물과 상보적으로 결합하는 캡처 DNA - 형광물질들을 포함할 수 있고, 상기 형광물질은 각 캡처 DNA 종류 별로 상이한 형광물질이 결합되어 있을 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 하나 이상의 표적 물질을 동시에 검출하는 다중 분석이 가능한지 확인하기 위해 SARS-CoV-2 유래 RBD 및 RdRp 유전자를 표적으로 하여 본 발명의 분석법을 진행한 결과, 하나의 표적 핵산이 있는 경우는 그에 대응하는 하나의 형광 신호만 액적의 중앙에 나타나고, 2가지 이상의 표적이 존재하는 경우에는 형광 신호가 혼합되어 중앙에 나타남을 확인하였다 (실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, Cellulose Nitrate 필터 종이가 아닌 일반 필터 종이를 이용하고, 캡처 DNA-형광 물질의 예로 일반 형광 물질보다 훨씬 강한 형광을 좁은 파장대에서 발생한다고 알려진 양자점을 이용하여 제조한 캡처 DNA-양자점을 이용하여 본 발명의 분석법을 실시한 결과, 표적 핵산이 존재하면 원의 중앙에서 강한 형광 신호를 확인하여 형광 링 패턴이 억제됨을 확인할 수 있었다 (실시예 7 참조).

상기 결과들은 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출방법이 다양한 시료로부터 표적 핵산을 민감하고 신속하게 검출 및 진단할 수 있는 플랫폼 기술임을 입증하는 것이다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 포함하는, 표적 핵산 검출센서를 제공한다. 상기 검출용 조성물을 이용하여 표적 핵산을 검출할 수 있는 센서 기술이라면 모든 기술을 이용할 수 있으며, 특별히 센서 기술의 종류나 특성에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 센서 시스템은 키트(Kit)의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 키트는 상기 검출용 조성물과 함께 버퍼 (buffer), DNA 중합효소 보조인자 (DNA polymerase cofactor) 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트 (dNTP)와 같은 표적 핵산 증폭 반응 (예컨대, 중합효소연쇄반응)을 실시하는데 필요한 시약을 모두 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 피검자 유래 생물학적 시료를 상기 검출용 조성물에 첨가하고 반응시키는 단계;

상기 반응 용액을 필터 종이 위에 떨어뜨린 후 형성되는 형광 링 패턴의 모양을 관찰하는 단계를 포함하되,

상기 반응 용액은 등온증폭 반응 및 캡처 DNA-형광 물질과 표적 핵산의 결합반응이 동시에 일어난 것을 특징으로 하는, 표적 핵산의 검출방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "형광 링 패턴 (fluorescent ring pattern)"이란 형광 물질이 포함된 용액이 종이 상에서 모세관 현상에 의해 방사형으로 이동하여 원의 가장자리에서 형광 물질이 위치함으로써 형성되는 링 패턴을 의미한다.

상기 생물학적 시료 내에 표적 핵산이 존재하는 경우, 표적 핵산과 본 발명의 표적 핵산에 특이적인 프로브의 상보적 결합에 의해 프로브의 닉 부분이 리가아제 효소에 의해 연결되어 환형의 주형이 형성되고, 이를 주형으로 회전환 증폭이 일어나 반복적이고 긴 단일 가닥의 DNA 증폭이 유도된다. dNTP가 충분히 공급되는 한 무한적으로 반복적 서열의 증폭을 유도되며, 상기 프로브와 상보적인 서열로 이루어진 증폭 산물은 새로이 형성되는 산물에 의해 밀려 주형이 되는 프로브에서 떨어져나가 결과적으로 형광물질이 결합되어 있는 캡처 DNA와 상보적 결합을 형성할 수 있는 긴 반복 서열의 단일가닥을 형성한다. 이러한 긴 단일가닥 DNA 내 반복적으로 존재하는 표적 핵산서열과 캡처 DNA의 상보적 결합에 의해 응집이 유도된다. 상기 응집물이 포함된 반응 용액을 필터 종이 위에 떨어뜨리면 캡처 DNA에 결합되어 있는 형광물질에 의해 형성되는 액적의 패턴을 형광으로 바로 확인할 수 있으며, 바람직하게 UV 램프 하에서 관찰할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 체외로 분리된 조직, 기관, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 상기 조직은 예컨대 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함될 수 있고, 상기 기관은 예컨대 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함될 수 있으나, 상기 시료의 범위가 이것으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 반응은 1분 이상, 구체적으로는 3분 이상, 보다 구체적으로는 5분 이상 수행되는 것일 수 있다. 상기 반응이 1분 미만으로 수행될 경우, 반응이 충분히 일어나지 않아 형광 링 패턴이 명확하게 구분 또는 관찰되지 않을 수 있고, 상기 반응이 1분 이상으로 수행될 경우, 형광 링 패턴이 명확하게 구분 또는 관찰될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 반응은 20 내지 50℃, 20 내지 45℃, 20 내지 40℃, 25 내지 50℃, 25 내지 45℃, 25 내지 40℃, 30 내지 50℃, 30 내지 45℃ 또는 30 내지 40℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있다.

상기 반응이 20℃ 미만 또는 50℃ 초과의 온도에서 수행될 경우, 반응이 제대로 일어나지 않아, 형광 링 패턴이 명확하게 구분 또는 관찰되지 않을 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 필터 종이는 바람직하게는 Cellulose Nitrate일 수 있으나, 일반 필터 종이를 이용한 경우에도 가능하므로 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 필터 종이의 기공의 크기는 등온증폭 산물-캡쳐 DNA-형광 물질이 입체적 장애로 인하여, 캡쳐 DNA-형광 물질보다 느리게 이동할 수 있다면 무방하나, 캡쳐 DNA-형광 물질이 통과할 수 없을 정도로 작은 크기는 아니어야 한다. 예를 들어, 상기 필터 종이의 기공의 크기는 0.01 내지 100 μm, 0.01 내지 50 μm, 0.01 내지 10 μm, 0.05 내지 100 μm, 0.05 내지 50 μm, 0.05 내지 10 μm, 0.1 내지 100 μm, 0.1 내지 50 μm 또는 0.1 내지 10 μm일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 형광 링 패턴 형태의 관찰을 통한 표적 핵산의 검출(도 1)

유전자 물질을 신속하고, 간단하게 검출하는 방법을 개발하는 것은 질병의 진단 및 후속 치료에 있어서 매우 중요하다. 이 중 유전자에 기반한 진단은 핵산 증폭 기술을 통해 소량의 표적을 높은 특이도로 분석할 수 있으며, 등온증폭 방법은 간단하고, 소형화된 장비를 통해 수행 가능하므로 현장 진단 플랫폼에 더욱 적합하다.

이에, 본 발명자들은 등온증폭 방법 중 하나인 회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA)을 이용하여 표적 유전자 물질을 일정 서열을 반복하는 긴 단일 가닥의 DNA로 증폭시키는 것과 동시에, 그 산물에 상보적인 서열을 지닌 캡처 DNA-형광 물질을 혼성화 시키고, 혼성화를 통해 생성된 증폭 산물-캡처 DNA 응집물이 포함된 액적이 종이 상에서 어떠한 형광링 패턴을 나타내는지 관찰하여 표적의 유무를 판단하는 간단한 진단법을 개발하였다.

보다 구체적으로, 표적 유전자의 핵산에 대한 상보적인 서열을 포함하는 핵산 프로브 (Padlock probe)의 nick 부분이 표적 유전자와의 결합에 의해 가까워지면, T4 리가아제(ligase) 효소에 의해 결찰 (ligation)되면서 원형의 DNA 주형(template)이 생성된다. 이러한 주형을 기반으로 등온 조건 하에서(37℃) RCA 프라이머를 기시점으로 phi29 중합효소는 단방향 복제를 통해 표적 서열의 다중 카피를 포함하는 긴 단일 가닥의 DNA를 생성하게 된다. 전술한 바와 같이 증폭 산물인 긴 단일 가닥 DNA는 일정한 표적 서열이 반복되는 구조로서, 증폭과 동시에 캡처 DNA-형광 물질과 상보적으로 결합하여 증폭 산물-캡처 DNA 응집물이 형성되며, 이러한 증폭 및 캡처 DNA-형광 물질과의 결합을 통한 형광 표지 과정은 30분 이내에 충분히 이루어진다.

진단을 위한 형광 링 패턴 관찰에 사용되는 상기 응집물이 함유된 용액의 필요한 용량은 1-5μl의 작은 용량으로, 이 방울을 Cellulose Nitrate 필터 종이에 떨어뜨리면 용액은 모세관 현상에 의해 원의 중앙에서 가장자리로 둥글게 퍼져나간다. 용액 내 입자가 필터의 기공 크기보다 큰 경우, 구동력에 제한을 받아 액적의 중앙에 밀집하게 된다. 수 마이크론 크기의 증폭 산물-캡쳐 DNA 응집 물질은 기공에 가로막혀 이동을 할 수 없으므로 액적의 중앙에 위치하고, 캡쳐 DNA-형광 물질은 액적의 가장자리로 이동하여 링 패턴을 형성한다. 본 발명에 따르면, 종이에 떨어뜨린 방울은 별도의 건조 시간 없이 바로 형광 링 패턴의 모양을 확인할 수 있어, 건조 환경의 영향을 고려할 필요가 없는 장점이 있다.

실시예 2. 필터 종이의 기공 크기에 따른 형광 링 패턴의 확인

본 발명자들은 균일하고 작은 크기의 기공일수록 입자의 이동이 상대적으로 어려워지므로 형광 링 패턴의 변화가 클 것이라고 예상하였고, 이를 확인하기 위해, 11 μm 또는 2.5 μm 크기의 기공을 갖는 alpha-cellulose(AC) 및 0.45 μm 또는 0.2 μm 크기의 기공을 갖는 Cellulose Nitrate(CN) 필터 종이에서 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 진행한 후 형광 링 패턴의 모양을 관찰하고 이미지를 분석하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 예상한 바와 같이 균일하고 작은 크기의 기공일수록 증폭 산물-캡쳐 DNA응집물이 더 중앙으로 모여 강한 형광 신호가 나타남을 확인하였다.

실시예 3. 형광 링 패턴 기반 검출법의 최적화 조건 확인

본 발명자들은 형광 링 패턴 기반의 검출법이 어떤 조건 하에 가장 최적으로 이루어지는 지 확인하고자 하였다. 이를 위해, 형광의 여기(excitation) 파장, 증폭 배양 시간 및 온도를 다양하게 하여 형광 링 패턴의 변화를 관찰하였다.

형광의 여기 파장을 변화시켜 형광 링 패턴을 확인한 결과, 도 3a에서 볼 수 있듯이, 254 nm에서 액적의 중앙에 밀집한 증폭 산물-캡쳐 DNA응집물이 나타내는 형광 신호를 더 명확하게 얻을 수 있었다. 254 nm 파장에서 365 nm에서보다 더 강한 형광 신호를 방출하므로 신호 대 잡음비 (signal-to-noise ratio)가 증가하기 때문에 형광 링 패턴 이미지가 더 뚜렷하게 나타남을 확인하였다.

또한, 증폭 배양 시간을 5분, 10분, 20분 및 30분으로 변화시키면서 형광 링 패턴을 확인하였을 때, 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이 배양 시간이 5분 이상만 지나도 형광 링 패턴이 억제되는 것을 볼 수 있었다. 5분 동안 증폭 과정을 가진 용액의 액적은 원 전체에 형광 신호를 갖는 반면, 표적이 없는 경우는 원의 가장자리에서만 신호를 나타냈다. 배양 시간이 길수록 액적의 중앙 영역에서 더 밀집된 신호를 관찰할 수 있었고, 20분 이상 배양된 용액은 중앙 부분이 외부보다 더 높은 신호를 보였다.

마지막으로, 적합한 증폭 배양 온도를 확인하기 위해 다양한 온도 조건(25℃, 28℃, 32℃, 34℃ 및 37℃)에서 증폭 과정을 진행한 결과, 도 3c에서 볼 수 있듯이, 34℃ 및 37℃ 조건에서 가장 효율적으로 형광 링 패턴이 억제됨을 확인하였다.

실시예 4. 표적 유전자 핵산 농도에 따른 형광 링 패턴 관찰 및 이미지 분석

본 발명자들은 상기 실시예들의 결과에 기반하여, 응집물의 형광 링 억제 패턴이 표적의 농도에 따라 그 효율이 달라지는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 표적 핵산을 다양한 농도(0, 0.1, 0.3, 0.5, 0.8, 1, 5 및 10 pmol)로 처리하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 진행한 후 형광 링 패턴의 모양을 관찰하고 이미지를 분석하였다.

그 결과, 도 4a 및 도 4b의 형광 링 패턴 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이 표적 핵산의 농도가 높을수록 원의 중앙에 위치하는 형광 신호가 강해지는 것을 관찰하였다.

실시예 5. 표적 유전자의 선택적 검출 확인

다음으로, 본 발명자들은 표적 유전자 물질이 단독으로 존재하지 않아도 선택적으로 검출이 가능한지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 각각 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 내 수용체 결합 도메인(Receptor binding domain; RBD)을 암호화하는 유전자, SARS-CoV-2의 RNA 의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase; RdRP) 유전자 및 메티실린 내성 포도상구균 (MRSA)의 mecA 유전자에 대하여 RBD 유전자 단독 또는 2개 유전자 또는 3개 유전자를 처리하였고, RBD 유전자를 표적 핵산으로 하여 이에 대한 캡처 DNA-형광 물질을 이용해 분석을 진행하였다.

그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이 표적 유전자 물질인 RBD가 처리된 조건에서는 모두 형광 신호가 액적의 중앙에 밀집하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 표적 유전자 물질이 단독으로 존재하지 않아도 충분한 선택성을 가지고 형광 링 패턴이 억제되는 현상이 나타남을 확인하였다.

실시예 6. 다중 표적 유전자의 검출 확인

또한, 본 발명자들은 본 발명의 검출법이 형광 신호의 패턴을 측정하는 방법을 이용하기 때문에, 다양한 파장대의 형광 물질을 이용하여 캡처 DNA-형광 물질을 사용하면 여러 유전자를 표적으로 하는 다중분석이 가능할 것으로 예상하였다.

이를 확인하고자, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 특정 표적 물질은 그에 대응하는 하나의 핵산 프로브 (Padlock probe) 및 캡쳐 DNA-형광 물질 세트에 의해 증폭, 표지되므로 각기 다른 표적 유전자 물질(RBD, RdRP 및 mecA 유전자)과 결합하는 서열이 다른 핵산 프로브 및 다른 파장대의 emission (520 nm 및 610 nm)의 캡쳐 DNA-형광 물질을 사용하여 다중분석을 진행하였다.

그 결과, 도 6b에서 볼 수 있는 바와 같이 하나의 표적 핵산이 있는 경우는 하나의 형광 신호만 액적의 중앙에 나타났고, 2가지 이상의 표적이 존재하는 경우에는 형광 신호가 혼합되어 중앙에 나타남을 확인하였다. 본 기술은 2가지 이상의 표적 유전자 물질을 탐지하여 위양성 또는 위음성 결과의 가능성을 줄일 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 7. 양자점 또는 AC 필터 종이를 이용한 조건에서 형광 링 패턴 관찰을 통한 표적 핵산 검출

본 발명자들은 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서 Cellulose Nitrate(CN) 필터 종이 대신 AC 필터 종이를 이용하는 경우, 및 캡처-DNA 형광 물질로써 일반 형광 물질이 아닌 양자점을 이용하는 경우 형광 링 패턴의 모양을 관찰하여 표적 핵산의 검출 여부를 확인할 수 있는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 표적 핵산을 다양한 농도(0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 10, 50 및 100 pmol)로 처리하여 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 RCA 등온증폭 반응을 진행하고, 캡처 DNA-형광 물질 혹은 캡처 DNA-양자점을 이용하여 혼성화를 진행한 후 응집물 한 방울을 일반 필터 종이에 떨어뜨린 후 형광 링 패턴의 모양을 관찰하였다.

그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이 CN 필터 종이 대신 더 저렴한 일반 필터 종이를 사용하여도 표적 핵산이 존재하면 원의 중앙에 밀집하는 형광 신호를 확인할 수 있었으며, 도 7b에서 볼 수 있는 바와 같이 캡처 DNA-양자점을 이용한 경우에도 표적 핵산의 농도가 높아질수록 원의 중앙에 위치하는 형광 링 패턴이 억제되는 동일한 현상을 관찰할 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.