Colloidal gold preparation method for test strip for detecting Helicobacter pylori IgG antibody and preparation method of test strip

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下所有实施例和对比例中的百分数均为质量百分数。

实施例1

一种胃幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试纸条用的胶体金制备方法，包括如下步骤：

（1）于250mL规格的三口烧瓶中加入0.02%的HAuCl₄溶液100mL，将三口烧瓶置于磁力搅拌电热套上，冷凝回流加热至沸腾，300rpm转速搅拌迅速加入2%柠檬酸钠溶液2mL反应，三口烧瓶内溶液由黄色经无色转为黑色，后逐渐呈粉红色，继续冷凝回流加热10min生成晶种液，冷却后备用；

（2）于500mL规格的三口烧瓶中加入256mL水和0.1%浓度的HAuCl₄溶液30mL，将三口烧瓶置于磁力搅拌电热套上，冷凝回流加热至75℃；

（3）加入2%的柠檬酸钠溶液1mL后，开启磁力搅拌开关，搅拌均匀生成混合液，并继续加热；

（4）待步骤（3）中生成的混合液由金黄色渐浅至稳定时，迅速加入步骤（1）中制备的晶种液6mL，并开启磁力搅拌器300rpm搅拌反应；

（5）反应结束后电热套转速调至100rpm，加热冷凝回流10min生成胶体金溶液。

一种胃幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

结合垫a的制备：取上述制得的胶体金溶液，用0.2M浓度的K₂CO₃溶液搅拌调节胶体金溶液pH值至7.8，将胃幽门螺旋杆菌抗原按4μg/mL加入到胶体金溶液中搅拌反应5min后，加入终浓度为0.5%的BSA封闭剂反应20min完成标记，将标记后的胶体金在4 ℃下9000rpm离心20min，去除上清后用复溶液复溶至原体积的1/10，将复溶后的液体按0.5mL/cm²涂至玻璃纤维上烘干制成结合垫a；

（2）结合垫b的制备：取上述制得的胶体金溶液，用0.2M浓度的K₂CO₃溶液搅拌调节胶体金溶液pH值至7.8，将鼠IgG按4μg/mL加入到胶体金溶液中搅拌反应5min后，加入终浓度为0.5%的BSA封闭剂反应20min完成标记，将标记后的胶体金在4℃下9000rpm离心20min，去除上清后用复溶液复溶至原体积的1/10，将复溶后的液体按0.5mL/cm²涂至玻璃纤维上烘干制成结合垫b；

步骤（1）、（2）中复溶液的配方为：0.2%（W/V）Tris，0.75%（W/V）酪蛋白，0.8%（W/V）BSA，0.8%（W/V）吐温-20，0.5%（W/V）蔗糖，pH7.8；

（3）样品垫制备：取10g Triton X-100、10g聚乙烯吡咯烷酮、5g表面活性剂S9，15g牛血清白蛋白，8mL Tween-20，用8mM磷酸缓冲液定容至1L，调节最终pH值为8.0后将玻璃纤维放入浸泡，捞出后烘干制成样品垫。

（4）质控线、检测线包被：分别将鼠抗人IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体按照1.4mg/mL和1.3mg/mL包被于硝酸纤维素膜上。

（5）将样品垫、结合垫a、结合垫b、硝酸纤维素膜和吸水纸按序粘贴于底板上，裁剪为2mm宽后组装于卡壳内，即得试纸条。

实施例2

一种胃幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试纸条用的胶体金制备方法，包括如下步骤：

（1）于250mL规格的三口烧瓶中加入0.02%的HAuCl₄溶液100mL，将三口烧瓶置于磁力搅拌电热套上，冷凝回流加热至沸腾，300rpm转速搅拌迅速加入2%柠檬酸钠溶液2mL反应，三口烧瓶内溶液由黄色经无色转为黑色，后逐渐呈粉红色，继续冷凝回流加热12min生成晶种液，冷却后备用；

（2）于500mL规格的三口烧瓶中加入260.7mL水和0.1%浓度的HAuCl₄溶液30mL，将三口烧瓶置于磁力搅拌电热套上，冷凝回流加热至75℃；

（3）加入2%的柠檬酸钠溶液2mL后，开启磁力搅拌开关，搅拌均匀生成混合液，并继续加热；

（4）待步骤（3）中生成的混合液由金黄色渐浅至稳定时，迅速加入步骤（1）中制备的晶种液8mL，并开启磁力搅拌器300rpm搅拌反应；

（5）反应结束后电热套转速调至100rpm，加热冷凝回流10min生成胶体金溶液。

一种胃幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

结合垫a的制备：取上述制得的胶体金溶液，用0.2M浓度的K₂CO₃溶液搅拌调节胶体金溶液pH值至7.8，将胃幽门螺旋杆菌抗原按4μg/mL加入到胶体金溶液中搅拌反应5min后，加入终浓度为0.5%的BSA封闭剂反应20min完成标记，将标记后的胶体金在4℃下9000rpm离心20min，去除上清后用复溶液复溶至原体积的1/10，将复溶后的液体按0.5mL/cm²涂至玻璃纤维上烘干制成结合垫a；

（2）结合垫b的制备：取上述制得的胶体金溶液，用0.2M浓度的K₂CO₃溶液搅拌调节胶体金溶液pH值至7.8，将鼠IgG按4μg/mL加入到胶体金溶液中搅拌反应5min后，加入终浓度为0.5%的BSA封闭剂反应20min完成标记，将标记后的胶体金在4℃下9000rpm离心20min，去除上清后用复溶液复溶至原体积的1/10，将复溶后的液体按0.5mL/cm²涂至玻璃纤维上烘干制成结合垫b；

步骤（1）、（2）中复溶液的配方为：0.2%（W/V）Tris，0.75%（W/V）酪蛋白，0.8%（W/V）BSA，0.8%（W/V）吐温-20，0.5%（W/V）蔗糖，pH7.8；

（3）样品垫制备：取10g Triton X-100、10g聚乙烯吡咯烷酮、5g表面活性剂S9，15g牛血清白蛋白，8mL Tween-20，用8mM磷酸缓冲液定容至1L，调节最终pH值为8.0后将玻璃纤维放入浸泡，捞出后烘干制成样品垫。

（4）质控线、检测线包被：分别将鼠抗人IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体按照1.4mg/mL和1.3mg/mL包被于硝酸纤维素膜上。

（5）将样品垫、结合垫a、结合垫b、硝酸纤维素膜和吸水纸按序粘贴于底板上，裁剪为2mm宽后组装于卡壳内，即得试纸条。

实施例3

一种胃幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试纸条用的胶体金制备方法，包括如下步骤：

（1）于250mL规格的三口烧瓶中加入0.02%的HAuCl₄溶液100mL，将三口烧瓶置于磁力搅拌电热套上，冷凝回流加热至沸腾，300rpm转速搅拌迅速加入2%柠檬酸钠溶液2mL反应，三口烧瓶内溶液由黄色经无色转为黑色，后逐渐呈粉红色，继续冷凝回流加热15min生成晶种液，冷却后备用；

（2）于500mL规格的三口烧瓶中加入262mL水和0.1%浓度的HAuCl₄溶液30mL，将三口烧瓶置于磁力搅拌电热套上，冷凝回流加热至75℃；

（3）加入2%的柠檬酸钠溶液3mL后，开启磁力搅拌开关，搅拌均匀生成混合液，并继续加热；

（4）待步骤（3）中生成的混合液由金黄色渐浅至稳定时，迅速加入步骤（1）中制备的晶种液10mL，并开启磁力搅拌器300rpm搅拌反应；

（5）反应结束后电热套转速调至100rpm，加热冷凝回流10min生成胶体金溶液。

一种胃幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

结合垫a的制备：取上述制得的胶体金溶液，用0.2M浓度的K₂CO₃溶液搅拌调节胶体金溶液pH值至7.8，将胃幽门螺旋杆菌抗原按4μg/mL加入到胶体金溶液中搅拌反应5min后，加入终浓度为0.5%的BSA封闭剂反应20min完成标记，将标记后的胶体金在4℃下9000rpm离心20min，去除上清后用复溶液复溶至原体积的1/10，将复溶后的液体按0.5mL/cm²涂至玻璃纤维上烘干制成结合垫a；

（2）结合垫b的制备：取上述制得的胶体金溶液，用0.2M浓度的K₂CO₃溶液搅拌调节胶体金溶液pH值至7.8，将鼠IgG按4μg/mL加入到胶体金溶液中搅拌反应5min后，加入终浓度为0.5%的BSA封闭剂反应20min完成标记，将标记后的胶体金在4℃下9000rpm离心20min，去除上清后用复溶液复溶至原体积的1/10，将复溶后的液体按0.5mL/cm²涂至玻璃纤维上烘干制成结合垫b；

步骤（1）、（2）中复溶液的配方为：0.2%（W/V）Tris，0.75%（W/V）酪蛋白，0.8%（W/V）BSA，0.8%（W/V）吐温-20，0.5%（W/V）蔗糖，pH7.8；

（3）样品垫制备：取10g Triton X-100、10g聚乙烯吡咯烷酮、5g表面活性剂S9，15g牛血清白蛋白，8mL Tween-20，用8mM磷酸缓冲液定容至1L，调节最终pH值为8.0后将玻璃纤维放入浸泡，捞出后烘干制成样品垫。

（4）质控线、检测线包被：分别将鼠抗人IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体按照1.4mg/mL和1.3mg/mL包被于硝酸纤维素膜上。

（5）将样品垫、结合垫a、结合垫b、硝酸纤维素膜和吸水纸按序粘贴于底板上，裁剪为2mm宽后组装于卡壳内，即得试纸条。

本发明晶种制备过程中采用柠檬酸钠为还原剂，同时柠檬酸钠修饰在晶种表面起到稳定剂作用，晶种加入到反应临界的氯化金和柠檬酸钠混合液中时晶种周围氯化金会优先被柠檬酸钠还原出新的金原子簇，并被吸附在晶种表面，低温能够实现胶体金的缓慢均匀生长，晶种生长法可在粒径均一的小颗粒纳米金基础上制备出均一的大颗粒纳米金，生长过程中新还原出的金原子簇逐渐在晶种表面缓慢积累，避免爆发式成核导致的各种问题，从而制备出高品质的胶体金，提升胃幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试纸条的灵敏度和特异性。

对比例1：

本对比例所述的胶体金粒径大小与实施例1一致，本对比例所述的胶体金制备方法为柠檬酸钠一步还原法。

柠檬酸钠一步还原法：于250mL规格的三口烧瓶中加入0.01%的HAuCl₄溶液100mL，将三口烧瓶置于磁力搅拌电热套上，冷凝回流加热至沸腾，300rpm转速搅拌迅速加入2%的柠檬酸钠溶液0.75mL反应，冷凝回流加热15min即得。

对比例1制得的胶体金和实施例1制得的胶体金的紫外光谱扫描结果如图1所示，二者吸收峰波长均在530nm左右，实施例1制得的胶体金的峰宽小于对比例1制得的胶体金，即胶体金溶液中纳米金优势粒径一致，实施例1制备的胶体金粒径更加均一，胶体金性能更加稳定。

对比例2：

本对比例与实施例1的不同之处在于本对比例胶体金的制备采用柠檬酸钠一步还原法，其余操作均一致，柠檬酸钠一步还原法：

于250mL规格的三口烧瓶中加入0.01%的HAuCl₄溶液100mL，将三口烧瓶置于磁力搅拌电热套上，冷凝回流加热至沸腾，300rpm转速搅拌迅速加入2%的柠檬酸钠溶液0.75mL反应，冷凝回流加热15min即得。

胃幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试纸条的灵敏度及特异性对比：

将实施例1与对比例2所制备的胃幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试纸条分别对阴性样本和阳性样本进行检测对比，结果如表1和表2：

表 1

表 2

实验结果可以得出，实施例1对阳性样本的真阳率和真阴率均比对比例2高；同时，实施例1试纸条的假阳率和假阴率也低于对比例2，说明本发明所制备的试纸条的灵敏度和特异性性能显著优于常规胶体金法制备的试纸条。

将同一阳性样本进行稀释后，对实施例1与对比例2所制备的胃幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试纸的检测能力进行测试对比，统计得表3：

表 3

“-”表示阴性，“+”表示阳性，“+”越多表示阳性显色越强。

实验结果可以得出，实施例1对低浓度阳性样本的显色效果优于比对比例2，阳性样本进行100倍稀释后，常规胶体金法制备的试纸条无法成功检出时，实施例1仍可检出。

综上说明，本发明制备的试纸条灵敏度和特异性等方面显著优于常规胶体金法制备的试纸条。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。